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GABA能中间神经元在Trim32基因敲除小鼠认知障碍中的作用和机制研究

邹明明  
【摘要】:自闭症谱系障碍(ASD)是一组主要以社会交往障碍和参与限制、重复性的行为为特征的疾病。众所周知,很多自闭症患者共同存在认知问题。自闭症谱系障碍具有高遗传性,越来越多的自闭症的遗传风险位点已被确认。近来,Trim32在9q33.1位点罕见的拷贝数变异被证实与人类自闭症相关。Trim32属于TRIM家族的成员,作为E3泛素连接酶参与多种生物学过程,如细胞增殖、分化为神经元、神经发育、凋亡。Trim32的多种基因突变导致多种具有不同的表型的遗传疾病,如巴尔得-别德尔综合征,2型肌带营养不良,肌管肌病,表皮癌、银屑病、阿尔茨海默症和抑郁症等。在动物和人类,海马负责学习和记忆。然而,对其解剖学基础及其细胞和生物学机制却仍知之甚少。某些形式的自闭症推测可能是由突触传递的抑制和兴奋之间的失衡造成的。GABA能中间神经元通过对兴奋性神经元的直接抑制作用成为调节大脑皮层和海马的内在活性的中枢。改变突触前GABA水平或突触后受体的反应,造成了GABA能功能缺陷,将导致兴奋/抑制环路的失衡,从而导致癫痫。然而,Trim32是否影响海马GABA能中间神经元,突触活性和海马依赖的学习和记忆知之甚少。在这里,我们使用trim32KO小鼠研究Trim32在海马GABA能神经元上的功能。第一部分海马Trim32的表达情况我们通过免疫荧光染色方法观察了在出生后7天和3个月小鼠Trim32的表达,通过Western blot蛋白质印迹技术检测在发育过程中出生后0天、7天、15天、1个月及2个月大小鼠,分别代表发育的新生儿、出生后早期、青少年和成年阶段的Trim32表达情况。结果1.Trim32属于TRIM家族,在新生及成年小鼠大脑海马CA1、CA3、DG区的神经元、GABA能中间神经元以及神经祖细胞上都有表达。2.在小鼠出生后的发育过程中,出生后0天到成年2月期间内的所有时间点小鼠的大脑海马都有Trim32表达,出生后0天最低,7天时略有增加,而且随着小鼠出生后的发育,Trim32在海马的表达量趋于稳定。3.Trim32在海马神经干细胞上也有表达。第二部分Trim32在小鼠海马中神经发生中的作用接下来,我们对Trim32KO和同窝野生型对照小鼠海马进行Brd U标记增殖和神经发生,验证Trim32是否是参与海马神经发生和相关的认知功能;小鼠腹腔注射标记Brd U 7天在颗粒细胞下区检测增殖,而腹腔注射Brd U后28天在颗粒细胞层检测神经发生。我们还采用免疫荧光染色分别评估了齿状回的颗粒下区颗粒细胞层未成熟DCX+和成熟的神经元Neu N+及程序性神经元凋亡标志物caspase-3+细胞密度。通过两个海马依赖的学习和记忆任务如Morris水迷宫,新物体识别,我们测试了Trim32的野生型和Trim32敲除小鼠的联想和非空间认知行为之间的差异。结果1.Trim32基因敲除小鼠海马齿状回神经干细胞增殖增加,迁移未受影响而神经发生减弱。2.Trim32基因敲除小鼠海马齿状回细胞凋亡减少。3.Trim32基因敲除小鼠在检测学习和记忆的水迷宫和新事物识别实验中表现不佳。第三部分Trim32基因敲除小鼠中GABA能中间神经元的变化了解Trim32缺失对GABA能中间神经元的影响是阐释Trim32功能丧失可导致认知功能障碍的关键步骤。我们采用免疫荧光染色计数了海马DG、CA1和CA3区的GABA能中间神经元亚群小清蛋白,神经肽Y、钙视网膜蛋白,生长抑素,GABA和GABA合成酶的亚型之一--GAD67的阳性细胞。为研究Trim32缺乏是否影响突触发育,我们定量分析了成年Trim32WT、KO小鼠海马CA3区突触前末梢标记物GAD67和抑制性突触标记物VIAAT的小点光密度。为分辨VIAAT阳性小点密度的降低到底是由于抑制性突触密度的下降还是存在于现有突触中VIAAT量的减少,我们用透射电镜计数了Trim32KO和野生型对照小鼠胞体周围抑制性突触的数量。而后,采用反相高效液相色谱法测定海马组织中神经递质GABA的浓度。为确定减少的的GABA能中间神经元是否将导致功能的变化,我们比较了7周大的Trim32KO和野生型小鼠海马脑片GABA-A受体介导的全细胞自发抑制性突触后电流和微小抑制性突触后电流的改变。采用全细胞膜片钳技术在海马CA1区锥体神经元上进行记录。海马GABA能中间神经元数量的减少及抑制性突触的减少可以导致神经兴奋性增高并产生癫痫表型,故我们使用视频脑电图监测了Trim32KO和Trim32WT小鼠的脑电活动。由于星形胶质细胞与神经细胞的兴奋性密切相关,为了验证Trim32KO小鼠脑内网络异常兴奋性的增强是否与海马处星形胶质细胞的表达改变相关,我们用免疫荧光染色观察GFAP在海马齿状回的表达情况。结果1.Trim32KO小鼠在发育后期阶段(出生后21天)和成年(4个月)GABA能中间神经元标记物的表达显著减少。2.在光镜水平,Trim32缺失小鼠海马CA3区VIAAT阳性小点密度明显降低。3.与光学显微镜结果一致,电镜观察到Trim32KO小鼠抑制性突触的数量减少。4.Trim32KO小鼠海马所含GABA与野生型小鼠相比浓度更低。5.电生理研究表明Trim32缺乏导致s IPSCs的频率降低,不影响s IPSCs和m IPSCs的振幅。而e IPSCs试验表现出幅度的增加和50ms的刺激间距时PPR增加。提示GABA递质释放的减少是由突触前动作电位不足造成的,Ca2+依赖的尖峰相关递质释放减少。6.脑电图检测发现Trim32KO小鼠表现出兴奋性增加,与对照组相比Trim32缺失可导致海马癫痫样棘波数量增加。7.Trim32基因敲除小鼠海马星形胶质细胞数量增加。第四部分氯硝西泮对Trim32基因敲除小鼠超兴奋性及认知障碍的影响Trim32KO小鼠的认知障碍可能是由GABA能中间神经元介导的抑制性突触传递降低而引起的。为了进一步验证这一假设,我们使用苯二氮卓类抗癫痫药物氯硝西泮治疗成年Trim32KO小鼠,逆转GABA能的降低。我们采用视频脑电图(EEG)监测,评价了用氯硝西泮治疗后小鼠的电活动的变化。为了评估行为的灵活性和持久性,我们实施了水迷宫的逆转任务。结果抗癫痫药物氯硝西泮可挽救Trim32KO小鼠在脑电图超兴奋性增强,但未能逆转学习记忆上的行为缺陷。结论综上,我们的实验结果显示1.本研究提示Trim32小鼠海马广泛表达,定位于神经元、GABA能中间神经元及神经干细胞上,随神经发育稳定表达。2.Trim32缺失小鼠海马齿状回神经干细胞增殖增加,迁移未受影响而神经发生减弱伴随细胞凋亡减少,海马依赖的认知功能障碍。3.Trim32KO小鼠各种亚型的GABA能中间神经元数量的减少以及抑制性突触的减少,海马GABA递质含量减少,电生理证实Ca2+依赖的尖峰相关递质释放减少,且这可能是由突触前动作电位缺失引起的,这些变化造成了GABA环路介导的的抑制降低,从而使锥体神经元兴奋性的增高,导致Trim32缺失小鼠海马神经网络具有异常的超兴奋性特点。4.抗癫痫药物氯硝西泮可挽救Trim32KO小鼠在脑电图超兴奋性增强,但未能逆转认知障碍。我们推测Trim32基因敲除小鼠的认知障碍可能是由GABA能中间神经元的减少及引起的神经环路兴奋/抑制失平衡导致的。这些数据表明了Trim32在大脑发育中的功能性作用,将有助于更好地了解Trim32基因相关疾病如多动症和自闭症。


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