嗅鞘细胞和支链氨基酸对视神经损伤的修复作用

【摘要】：视神经损伤和变性疾患常导致视觉功能不可逆性损害。视神经属于中枢神经，因此缺乏自发性再生能力，其损伤将导致视网膜神经节细胞（节细胞）死亡。因此针对促进节细胞存活，以及视神经再生，寻求治疗方法以及研究其机理，对于救治此类眼疾具有十分重要的理论和临床应用意义。 第一部分嗅鞘细胞对损伤节细胞的体外保护作用。嗅鞘细胞（olfactoryensheathing cells,OECs）移植是一种治疗中枢神经损伤并重建其功能的优良方法。既往研究将OECs移植入损伤的脊髓和视神经，发现脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）表达升高，但是没有相关证据表明OECs直接通过分泌BDNF起到保护作用。为回答此问题，我们分为四方面进行实验验证。第一，建立了一种节细胞体外划伤模型；第二，通过相差显微镜观察了嗅鞘细胞条件培养基（olfactory ensheathingcell-conditioned medium,OEC-CM,含OECs分泌的各种因子）对损伤节细胞形态的影响。通过β-tubulinⅢ免疫荧光染色，观察了OEC-CM对损伤后节细胞存活数量的影响。通过MTT实验检测了OEC-CM对节细胞活性的影响；第三，通过western-blot方法检测了OEC-CM浓缩液中的BDNF量；第四，通过BDNF中和性抗体中和了BDNF的作用，研究了抑制BDNF作用后，OEC-CM对损伤的节细胞是否还有保护作用。结果显示：第一，虹膜刀划伤培养的节细胞后，其突起受损回缩；第二，OEC-CM在损伤区存活节细胞形态完整，突起较长，β-tubulinⅢ阳性的节细胞数量显著高于普通培养基组（NM）。损伤后检测的OD值在OEC-CM组高于NM组。第三，在OEC-CM浓缩液中检测到含量较高的BDNF；第四，BDNF中和性抗体阻断了OEC-CM对损伤节细胞存活的促进作用。结论：OECs可以分泌保护性因子对损伤的节细胞起保护性作用，且在OECs分泌因子中，BDNF对损伤节细胞的保护起了非常重要的作用。 第二部分眼玻璃体腔内移植嗅鞘细胞对视神经损伤后节细胞的保护作用。既往研究将OECs移植入损伤的视神经眶侧残段，但OECs在残段内存活时间较短，因此OECs对节细胞的保护作用只能维持到7d。因此，我们将OECs植入眼玻璃体腔内，研究OECs对视神经损伤后节细胞的保护作用。研究选取24只SD大鼠，建立视神经横断模型，并分为两组：OECs移植组，对照培养基移植组（sham组）。分别在损伤后7d和14d计数存活的节细胞密度。损伤后7d和14d，OECs组存活的节细胞密度高于sham组77%和126%，差异呈显著性（p0.05）。结论：植入玻璃体腔内的OECs能在视神经损伤后的较长时间内对节细胞发挥保护作用。 第三部分支链氨基酸（branched-chain amino acid, BCAA）是含有脂肪族侧链的氨基酸，它包含亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸。据研究报道食用BCAA可以促进大鼠创伤性脑损伤的认知功能及突触传递效能的恢复。但是视神经损伤后，BCAA能否促进节细胞存活和轴突再生，且这种作用的可能机理现在并不清楚。另外BCAA对视神经损伤有何种副作用，现在仍不清楚。因此我们分为五方面进行实验验证。第一，采用视神经横断模型检验BCAA对节细胞的保护作用，将54只SD大鼠分为3组：BCAA组，Threonine组和saline组。分别在损伤后2d，7d和14d观察节细胞的存活情况；第二，采用视神经横断-坐骨神经移植方法研究BCAA对视神经再生的作用。将14只SD大鼠分为2组：BCAA组（8只）和saline组（6只）进行治疗。损伤后25d进行荧光金逆行性标记。损伤后28d取视网膜进行计数，取视神经残段及移植的坐骨神经进行冰冻切片、GAP43免疫荧光染色。第三，研究了外源性BCAA对mTOR信号的活化作用。磷酸化S6（p-S6）的量可以反映mTOR信号的活化状态。将32只SD大鼠分为两组：BCAA组（16只）和saline组（16只）进行治疗，分别在损伤后1d，3d，7d和14d取眼球进行冰冻切片及p-S6和NeuN双重免疫荧光染色，计算节细胞层p-S6阳性细胞占NeuN阳性的节细胞的比率。第四，有研究发现BCAA对导致培养的星形胶质细胞形态改变，我们观察研究了BCAA对视网膜中特殊的星形胶质细胞（即muller细胞）形态的影响。将18只SD大鼠分为6组：正常视神经组（normal），正常视神经+saline处理组（normal+saline），正常视神经+BCAA处理组（normal+BCAA），损伤视神经组（injury），损伤视神经+saline处理组（injury+saline），损伤视神经+BCAA处理组（injury+BCAA）。处理或手术后7d取眼球进行冰冻切片和GFAP免疫荧光染色，观察GFAP阳性的muller细胞形态变化；第五，氧化损伤导致神经元死亡，抗氧化损伤对于中枢神经元存活至关重要。我们将24只SD大鼠分为2组：BCAA组和saline组。分别在损伤后1d，3d，7d，14d通过定量PCR检测抗氧化体系的调控分子PGC-1α以及抗氧化分子SOD1，SOD2，GpX1，catalase的表达情况，研究BCAA对抗氧化体系的作用。结果表明：第一，相比saline处理组，BCAA可以促进损伤后7d和14d存活的节细胞显著性增加，而Threonine没有此作用。第二，相比saline处理组，BCAA可以促进视神经再生以及视神经残段GAP-43阳性纤维增多。第三，相比saline处理组，BCAA促进损伤后1d，3d，7d p-S6阳性的节细胞比率增多。第四，损伤会导致GFAP免疫荧光染色的细胞形态产生变化，但是BCAA不会影响GFAP免疫荧光染色的细胞形态。第五，相比saline处理组，BCAA促使损伤后7d的PGC1-α表达上调，但会降低损伤后14d的SOD1和GPx1的表达。结论：BCAA对损伤节细胞有神经保护作用，并且会促进视神经在外周神经移植物中的再生。这些促进作用可能与BCAA对mTOR的活化相关。BCAA不会对muller细胞产生影响。但是BCAA对抗氧化体系的影响却比较复杂，需要进一步综合评价BCAA对抗氧化体系的影响。