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实验性咬合紊乱致大鼠髁突软骨细胞过度死亡及软骨下骨异常改建的机制研究

焦凯  
【摘要】:颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorders, TMD)是口颌面部第四大疾病,由磨牙咬合关系异常所导致的颞下颌关节(temporomandibularjoint, TMJ)异常受力被认为是TMD的可能致病因素之一。骨关节炎(osteoarthritis, OA)为重症TMD患者的典型病理改变,其主要表现为关节软骨进行性退变及软骨下骨改变。目前对TMJOA的病理实质和发病机理的认识还不甚清楚,致使其临床治疗效果不佳。因此,为了深入阐明TMJ OA的发病机理,有必要建立高度模拟临床TMJOA发病过程的仿真动物模型。关节软骨为无血管、无淋巴管的组织,因此长期以来一直被认为是惰性组织、免疫豁免区。尽管体内、外研究均表明软骨细胞具有一定的迁移、吞噬功能,尚未见到探索吞噬样软骨是否表达巨噬细胞特异性标志物的报道,而该细胞在软骨退变中的作用也不清楚。本研究首先揭示大鼠TMJ髁突增龄性变化特征,为后续TMJOA动物模型研究提供基线资料;其次以年轻大鼠为研究对象,通过正畸学方法建立不同类型磨牙咬合紊乱,论证磨牙咬合紊乱可作为独立因素造成大鼠TMJ软骨OA样改变;然后通过两次移动磨牙建立TMJ OA样变大鼠模型,针对此模型研究OA髁突软骨及软骨下骨病变的病理实质和发病机理;最后探索软骨特异性吞噬细胞的存在及其在OA软骨退变中的作用,以期为临床TMJ OA的治疗提供新策略。 首先采用大体测量、组织测量术、Micro-CT等方法探索2-7月龄大鼠颞下颌关节髁突软骨厚度及软骨下骨密度及显微结构的的增龄性特征,为后续软骨及软骨下骨病理学特征研究提供基线资料;据此结果,我们选择8周龄大鼠为研究对象,并以同龄同性别大鼠为对照,采用正畸学方法建立不同磨牙咬合异常模型,即推左上、右下颌第一磨牙(M1)向近中移动组(Exp_I),推左上、右下颌第三磨牙(M3)向远中移动(Exp_II),推两下颌M3向远中移动组(Exp_III),推两上颌M3向远中移动(Exp_IV),对照组不进行任何操作,采用HE及甲苯胺蓝组织学定量法研究磨牙咬合异常对TMJ髁突软骨组织形态的影响;随后采用以上方法首先造成左上、右下颌M1咬合紊乱,4周后再造成左上、右下颌M3咬合紊乱(双磨牙咬合紊乱组),以此建立TMJ髁突OA样变大鼠模型,通过免疫组化染色、TUNEL原位标记、实时定量PCR等实验手段探索实验8、12周后软骨细胞增殖及死亡平衡在OA软骨退变中的作用及其信号传导机制;继而采用Micro-CT、组织测量术、成骨动态标记、TRAP及免疫组化染色等方法探索软骨细胞异常分泌破骨相关因子M-CSF、OPG及RANKL在OA软骨下骨改变中的作用;最后综合运用体内及体外实验,以双磨牙咬合紊乱大鼠及其对照组TMJ以及OA患者及外伤截(对照组)肢膝关节标本为研究对象,通过透射电镜、western blot、流式细胞技术、细胞分选、活细胞工作站等方法探索软骨特异吞噬细胞在OA软骨退变中的作用。 实验结果: 1.大鼠TMJ髁突显著增龄性变化主要发生在2-5月龄,其中软骨厚度快速降低时间段:雌性为2到3月龄,雄性大鼠为2到4月龄;髁突软骨下骨密度(BMD)快速增加时间段:雌性为3到4月龄,雄性大鼠为3到5月龄;软骨下骨骨积极分数(BV/TV)及骨小梁厚度(Tb.Th)显著增加,而骨表面积/骨体积(BS/BV)及骨小梁数量(Tb.N)显著降低时间段:雌雄性均为3到4月龄。 2.磨牙移动组软骨局部出现退行性改变,表现为关节软骨中、后部成熟层与肥大层局部软骨间质均质嗜伊红染色及局部蛋白多糖丢失。其中雌性Exp_II、 Exp_III及Exp_IV组10个关节中分别有7、4及2个出现软骨退变,而雄性Exp_II、Exp_III及Exp_IV组10个关节中分别有2、1及1个出现软骨退变。对照组及Exp_I组未出现该变化。实验组典型的增殖性反应主要表现为自软骨肥大层向软骨下骨突起的“钉突状”结构,该区域内细胞排列散乱,原正常软骨分层结构紊乱,有的表现为肥大层细胞消失,增殖层细胞向下侵入至软骨下骨,细胞排列散乱;有的则表现为软骨细胞被细胞外基质分割包围,局部形成“岛样结构”。其中雌性Exp_III及Exp_IV组,雄性Exp_I、Exp_II、Exp_III、Exp_IV组及对照组分别有2、5、2、2、3、1及1个关节出现软骨增殖性反应。在雌性,Exp II(P=0.003)及ExpIII(P=0.018)组软骨退变率均显著高于对照组,而Exp I及Exp IV组与对照组无显著差异(P0.05)。Exp II组软骨退变率明显高于Exp I及Exp IV组(P 0.05),而与ExpIII组间无明显差异(P0.05)。在雄性,各实验组软骨退变率均与对照组无明显差异,且各实验组间也无明显差异(P0.05)。此外,雌性Exp II组软骨退变率明显高于雄性Exp II组(P=0.012)。 3.双磨牙咬合紊乱组雌性大鼠髁突软骨出现明显退变,主要表现为软骨表面损蚀样变,软骨基质出现无结构的均质嗜伊红纤维化及蛋白多糖丢失;软骨细胞数目明显减少,胞核固缩,个别部位软骨细胞聚集形成独立的“岛样结构”;软骨各层结构严重紊乱,呈乳突状突向软骨下骨,髁突后部软骨纤维层明显增生、肥厚,肥大层细胞结构紊乱。 4.双磨牙咬合紊乱组大鼠髁突软骨中、后部出现大量胞核固缩、嗜伊红染色的细胞,电镜下8周实验组病变软骨内凋亡细胞明显增多,其形态学特征为胞质突起消失、周围染色质边集化及胞内形态不规则的异染色质明显增多。12周实验组病变软骨内坏死软骨细胞明显增多,呈局灶性聚集。雌性12周实验组软骨内PCNA阳性细胞较其同龄对照组明显减少(P 0.05),其8及12周实验组软骨内TUNEL及caspase-3阳性细胞均明显增多(P 0.05)。然而,雄性仅12周实验组软骨内TUNEL及caspase-3阳性细胞较其同龄对照组减少(P 0.05),增殖细胞却未发生明显改变(P0.05)。雌性8及12周实验组caspase-3、caspase-9、MAP4K3、bax/bcl-2mRNA的表达均分别明显高于其同龄对照组(P 0.05),而caspase-8及P53的表达在实验组与对照组间则无明显差异(P0.05)。 5.双磨牙咬合紊乱组大鼠髁突软骨退变及钙化在实验8周开始出现,而明显的软骨下骨丢失则发生在实验12周,其主要特征为较其同龄对照组BMD、BV/TV及Tb.Th下降,但Tb.Sp增加(P 0.05)。伴随实验12周时的骨丢失发生的还有新生骨比率降低、血清CTXs升高及软骨下骨破骨细胞数量及面积的增加(P 0.05),表明实验12周时软骨下骨出现骨吸收。在12周实验组软骨退变区域周围的肥大层内,M-CSF、VEGF、RUNX-2及RANKL/OPG阳性细胞面积均较其同龄对照组明显增加(P 0.05),这与其mRNA水平变化相一致。此外,12周实验组RANKL/OPG的水平较8周实验组明显升高(P 0.05)。 6.3周龄大鼠TMJ髁突及膝关节软骨增殖层深部及肥大层浅部可见CD163阳性细胞,其分别为从髁突及膝关节软骨内分选出的Col-II阳性细胞的2.6%及3.3%,其中约70%具有吞噬功能。透射电镜结果显示双磨牙咬合紊乱组退变软骨内部分吞噬样软骨细胞正在吞噬其周边的凋亡及坏死细胞,且其软骨内CD163、TNF-α及MMPs基因及蛋白水平均较其同龄对照组明显增高(P 0.05),但软骨内ACP-1,NO及ROS的量则无明显差异。8周实验组及其对照组髁突软骨中的Col-II阳性细胞CD163表达及吞噬功能检测结果显示,实验组CD163表达及吞噬功能均较其同龄对照组明显增高(P 0.05),同样,外源性TNF-α也可显著增加原代软骨的细胞CD163表达及吞噬功能(P 0.05)。此外,在截肢膝关节软骨(对照组)中几乎看不到CD163或TNF-α阳性软骨细胞,而在膝关节OA软骨中CD163及TNF-α阳性细胞数目明显增多(P 0.05)。 由此得出以下结论: 1.大鼠TMJ髁突软骨及软骨下骨的增龄性变化主要发生在5月龄之前,主要表现为软骨变薄、软骨下骨骨量增多及骨小梁变厚,本实验为后续TMJ髁突软骨及软骨下骨病理学特征研究提供基线资料,且后续实验中要注意排除增龄性特征对判定结果的影响。 2.不同类型的磨牙咬合紊乱可造成雌性大鼠TMJ髁突软骨不同程度的退行性变,其中推左上、右下颌M3向远中移动所造成的软骨退变最为明显。 3.双磨牙咬合紊乱可以诱发雌性大鼠髁突软骨出现明显OA样改变,主要表现为软骨表面损蚀样变,软骨基质出现无结构的均质嗜伊红纤维化及蛋白多糖丢失,该模型可用于今后TMJOA致病机制的深入研究。 4.双磨牙咬合紊乱可致雌性大鼠TMJ髁突软骨出现以细胞增殖减弱及凋亡增加为典型特征的退行性变,由MAP4K3调控的内源性凋亡通路在退变软骨细胞过度凋亡中发挥重要作用。 5.双磨牙咬合紊乱致大鼠髁突软骨下骨丢失继发于软骨退变之后,而病变软骨内由软骨细胞异常分泌M-CSF、RANKL等促破骨因子可能在软骨下骨丢失过程中发挥重要作用。 6.关节软骨内存在CD163阳性吞噬细胞,其在退变软骨内数目增多、吞噬功能增强表明软骨自身具有清除退变组织的能力。


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