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CIAPIN1在上皮性卵巢癌中增殖作用的初步研究

蔡小兰  
【摘要】:上皮性卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,其致死率居妇科恶性肿瘤之首[1,2]。2012年统计数字显示,卵巢癌发病率位居妇女恶性肿瘤第五位,严重威胁妇女生命与健康。虽然手术技巧和显微外科技术不断进步,治疗措施推陈出新,多种化疗药物更新和临床应用方法优化,卵巢癌的5年死亡率仍然居高不下[2-6],无根本性的改善[7]。因此,寻找新的治疗靶点和治疗途径已经当务之急[8-10]。 CIAPIN1(Cytokine-induced apoptosis inhibitor1),即细胞因子诱导凋亡抑制因子,鼠源性同源分子为Anamorsin(AM)。在小鼠的前体B细胞系中,AM是受体酪氨酸激酶Ras信号通路中的下游效应分子,与已知的凋亡调节分子Bcl-2家族,caspase家族,和信号转导分子未显示同源性。CIAPIN1在细胞中表达完全依赖于生长因子[11]刺激。随着研究深入,发现CIAPIN1通过上调MAP-1和MRP-1参与胃癌多药耐药,减少化疗药物在肿瘤细胞内储留[12]。CIAPIN1在白血病细胞中上调MDR-1和Bcl-2,下调Bcl-x而抗肿瘤细胞凋亡,影响肿瘤细胞多药耐药[13]。CIAPIN1存在多种剪接体结构[14],在不同的肿瘤发生发展过程中作用不一,如胃癌和肾癌中呈低表达,在转录后水平通过抑制细胞周期相关蛋白cyclinD1等表达,抑制癌症细胞增殖[15,16];CIAPIN1下调p27,有利于肝癌细胞在小鼠体内形成肿瘤[17];CIAPIN1在白血病和肺癌组中呈高表达,与促进肿瘤进展有关[18,19]。下调CIAPIN1可以抑制VEGF表达,阻止肾癌和胃癌组织内血管形成[16,20],抑制肿瘤生长。CIAPIN1在肿瘤中的作用呈双面性,在卵巢癌中的功能悬而未决。 90%以上上皮性卵巢癌来源于卵巢表面具有生发功能的上皮细胞[21]。本课题以上皮性卵巢癌组织和配对的非癌性卵巢上皮组织临床标本为研究对象。首先在CIAPIN1蛋白表达水平进行检测,初步分析CIAPIN1与上皮性卵巢癌临床参数间的关系,继而在形态学上验证在卵巢癌细胞中CIAPIN1呈高表达。为了检测CIAPIN1在上皮性卵巢癌中生物学行为,本实验构建CIAPIN1shRNA载体,干扰CIAPIN1下调其表达,发现卵巢癌细胞增殖作用明显降低;反之,AdCIAPIN1正义重组腺病毒感染卵巢癌细胞上调其表达,发现卵巢癌细胞的增殖能力明显升高。体内成瘤实验进一步证明CIAPIN1能够促进卵巢癌发生和进展。本实验证明了CIAPIN1能够上调细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4和cyclinE/CDK2,参与NF-κB信号途径,初步阐述了CIAPIN1促进卵巢癌细胞增殖作用的分子机制。 本研究将为CIAPIN1参与上皮性卵巢癌增殖过程提供有力的直接证据,也为进一步阐述CIAPIN1在卵巢癌症发生和进展过程中所发挥的作用机制奠定扎实的基础,具有极其重要的理论意义和临床应用价值。 【目的】 1、检测CIAPIN1分子在上皮性卵巢癌组织中表达,分析其与上皮性卵巢癌病人临床病理参数间的关系;观察CIAPIN1在卵巢癌细胞系中表达差异,寻找靶细胞为下一步生物学实验奠定基础;2、建立CIAPIN1低表达和高表达卵巢癌细胞系,为进一步研究CIAPIN1在卵巢癌细胞中功能学实验提供有效手段;3、体内体外实验探讨CIAPIN1对卵巢癌细胞生物学行为的影响,为阐述CIAPIN1参与卵巢癌发生进展机制提供依据;4、初步分析CIAPIN1在卵巢癌细胞增殖过程中的作用机制。 【方法】 1.采用免疫组织化学方法,检测118例上皮性卵巢癌组织和108例非癌性卵巢上皮组织中CIAPIN1表达情况,分析其表达与临床参数之间关系;免疫印迹方法检测CIAPIN1蛋白在8对卵巢癌和配对资料组织中差异; 2.免疫印迹法验证CIAPIN1在五株卵巢癌细胞系中的表达差异;免疫细胞化学和免疫荧光细胞化学法观察CIAPIN1在卵巢癌细胞A2780和HO8910中分布和表达情况; 3.以pGPU6/GFP/Neo为载体,构建pGPU6/GFP/Neo CIAPIN1siRNA载体,并在卵巢癌细胞系A2780中检测其在mRNA和蛋白水平表达,G418筛选阴性对照组和低表达细胞株; 4.验证重组腺病毒AdCIAPIN1在卵巢癌细胞HO8910中的mRNA和蛋白表达情况; 5.MTT法、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术分别检测实验组和对照组、亲本细胞的生长曲线变化、克隆形成能力及细胞周期变化; 6.体内成瘤实验观察实验组和对照组、亲本细胞中CIAPIN1体内成瘤情况,检测CIAPIN1促进卵巢癌细胞的增殖能力; 7.免疫印迹法:分别检测过表达和抑制CIAPIN1表达与细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4、cyclinE/CDK2间关系以及总蛋白中IKKβ、磷酸化IKBα、p65及其磷酸化表达差异;分别检测p65以及磷酸化p65在实验组和对照组细胞核和细胞浆中表达; 8.细胞分选核转位系统检测p65在实验组和对照组、亲本卵巢癌细胞内核转位变化。 【结果】 1.CIAPIN1蛋白在上皮性卵巢癌中呈高表达,而在配对的非卵巢癌中无表达或低表达,差异显著,具有统计学意义(p0.05);CIAPIN1的表达与卵巢癌患者的病理分级及临床分期(FIGO)密切相关; 2.CIAPIN1在卵巢癌细胞系A2780中呈高表达,在H08910细胞系中,表达低于A2780,两者比较差异显著,具有统计学意义(p0.01),说明A2780和HO8910可作为卵巢癌靶细胞参与细胞生物学实验; 3.成功构建siRNA表达质粒CIAPIN1siRNA。Q-PCR及Western blot表明,siRNA抑制CIAPIN1在A2780细胞中表达,干涉效率均在80%以上; 4.G418筛选A2780细胞,获得稳定表达卵巢癌细胞株CIAPIN1siRNA(实验组),Con-siRNA(阴性对照组);Control(亲本细胞组) 5.重组腺病毒AdCIAPIN1感染HO8910细胞效率达到92%;Q-PCR及Western blot结果表明,AdCIAPIN1明显增强CIAPIN1在卵巢癌细胞HO8910中表达; 6.CIAPIN1siRNA明显抑制卵巢癌细胞A2780增殖。实验组与对照组/Control组相比:(1)MTT表明实验组细胞生长能力下降,具有统计学意义(p0.05);(2)实验组软琼脂克隆形成能力降低,有显著差异(p0.01);(3)实验组细胞周期阻滞在G1/S期,细胞增殖指数下降,差异显著,有统计学意义(p0.05);(4)体内成瘤实验也表明CIAPIN1siRNA抑制卵巢癌细胞在裸鼠体内成瘤能力,形成肿瘤体积明显小。与对照组相比,有统计学意义(p0.05); 7.卵巢癌细胞HO8910感染腺病毒后,实验组与对照组/Control组相比:(1)MTT表明实验组细胞生长能力增高,有统计学意义(p0.05);(2)实验组软琼脂克隆形成能力增强,有显著性差异(p0.05);(3)实验组细胞周期在G1/S期明显缩短,细胞增殖指数升高,有统计学意义(p0.05);(4)体内成瘤实验表明AdCIAPIN1促进卵巢癌细胞在裸鼠体内成瘤能力,体内形成肿瘤体积与对照组,差异显著,有统计学意义(p0.05); 8.CIAPIN1上调细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4和cyclinE/CDK2表达;在实验组和对照组/Control组中,下调CIAPIN1后,磷酸化IKBα、磷酸化p65表达下降,而上调CIAPIN1后,磷酸化IKBα、磷酸化p65表达升高;而IKKβ表达无明显的变化; 9.Western blot实验表明:在AdCIAPIN1实验组中,细胞核中磷酸化p65表达升高,而CIAPIN1siRNA实验组在细胞中磷酸化p65表达明显降低,说明CIAPIN1参与并激活NF-κB信号通路; 10.细胞分选核转位系统分析表明:下调CIAPIN1后,实验组中p65在细胞浆内表达,而上调CIAPIN1后,p65被激活转位至细胞核内;Control组和对照组无明显差异。 【结论】 (1)CIAPIN1在上皮性卵巢癌中高表达;CIAPIN1表达强度与上皮性卵巢癌的病理分级和临床病理分期相关; (2)CIAPIN1在上皮性卵巢癌细胞系中高表达,在恶性程度高的卵巢癌细胞A2780中表达强度高于恶性程度低的卵巢癌细胞HO8910; (3)建立了CIAPIN1高表达和低表达卵巢癌细胞系; (4)体内和体外实验证明CIAPIN1促进卵巢癌细胞增殖,CIAPIN1在卵巢癌细胞增殖进展过程中发挥了重要的作用; (5)CIAPIN1可以通过激活NF-κB信号途径,促进细胞周期蛋白表达,从而促进卵巢癌细胞增殖和进展。


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