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大鼠肝干细胞和肝癌干细胞间生物学特性差异分析及相关分子调控机制研究

刘卫辉  
【摘要】:【背景】 干细胞研究是近些年来的研究热点,其中包括正常干细胞(normal stemcells, NSCs)和肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs),针对这些干细胞的深入研究对于许多疾病的诊治具有十分重要的意义。NSCs无论对于机体的正常功能维持,还是对于疾病的异常功能修复,都占据着至关重要的地位。干细胞治疗是急、慢性终末期肝病最有前景的疗法,可用于肝病治疗的干细胞类型众多,主要分为肝内干细胞和肝外干细胞两类。胎肝干/祖细胞(fetal liverstem/progenitor cells, FLSPCs)属于肝内干细胞的典型代表,因其高存活、高增殖、小体积和高安全优势,成为干细胞治疗肝病的理想细胞之一。本课题应用三步分离法富集了FLSPCs,获得了与流式分选近似的分离效率。然而,要探索FLSPCs治疗潜能,以下两个问题急待解决:首先,如何保持FLSPCs自我更新;其次,如何促进FLSPCs准确分化为肝细胞和胆管细胞。 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是最易致死的癌症类型,全世界每年新发HCC中的40%~50%在我国大陆。虽然近几年HCC的诊断和治疗得到了一些发展,但是阐明HCC的发生和转移机理仍是解决HCC诊治的根本途径。HCC被推测起源于一小群细胞,这些细胞具有诸多类似干细胞的特征,因此被称为肝癌干细胞(hepatic cancer stem cells, HCSCs)。HCSCs起源起源被认为是HCC的重要发生机制之一,而HCC干细胞的来源之一被推测是正常肝干细胞(hepatcinormal stem cells, HNSCs)在诱癌因素刺激下发生恶性转化所致。因此,对比HNSCs和HCSCs之间的生物学特性差异,对于理解两者之间的相互关系具有重要意义。利用建立的干细胞分离法,本课题富集了HNSCs和HCSCs,对比了两种干细胞之间的生物学特性差异,并建立了两种干细胞间小RNA(microRNA, miRNA)和基因差异表达谱。 虽然HCSCs被推测来自于HNSCs的恶性转化,但是尚缺乏实际性的生物转化模型,同时参与该过程的具体分子机制尚不清楚。从获得的miRNA差异表达谱中,本课题挑选了在HCSCs极度下调的miRNA,miR-200a进行了深入研究。我们发现HNSCs中抑制miR-200a的表达会促进细胞增殖明显加快,并具有一定的侵袭和迁移能力,最终导致HNSCs发生恶性转化成为类似HCSCs的细胞。虽然上述研究结果已在“Stem Cell Rev”等多篇高水平国际杂志发表,但是miR-200a缺失介导恶性转化的分子机制尚不清楚。通过鉴定miR-200a缺失后影响的下游靶基因,我们发现ZEB作为miR-200a的靶基因参与了HNSCs向HCSCs恶性转化的调控作用。为了分析失调性miRNAs作为诊断HCC的分子标志物的可能性,我们对二乙基亚硝胺诱导大鼠HCC发生的各个阶段进行了检测,结果发现miR-200a的失调早于AFP的变化,有望是一个潜在的标志物。 【目的】 总体目标是对比HNSCs和HCSCs间的生物学特性,探索从HNSCs向HCSCs恶性转化的分子机制。主要包括三个具体目标:(1)大规模培养FLSPCs并保持其未分化状态,确定促进FLSPCs定向分化的优化条件。(2)系统对比HNSCs和HCSCs间的生物学特性,建立HNSCs和HCSCs间差异基因和miRNA表达谱。(3)选取代表性的miRNA或者基因,探索其介导HNSCs向HCSCs恶性转化过程中的部分关键分子机制。 【方法】 第一部分:HNSCs和HCSCs的分离鉴定 1、 FLSPCs的三步分离法富集(此部分已入硕士论文) 利用Percoll非连续密度梯度离心(percoll discontinuous gradientcentrifugation, PDGC)、差异消化和差异贴壁(differential trypsinization anddifferntial adherence, DTDA)、Percoll连续密度梯度离心(percoll continuousgradient centrifugation, PCGC)三个系列步骤成功分离了FLSPCs。 2、 HCSCs的三步分离法富集(此部分与王兴硕士合作完成,详见其论文) 利用二乙基亚硝胺造就Fisher344大鼠HCC模型,利用PDGC富集肝癌细胞(heptatic tumor cells, HTCs),通过DTDA对分离的HTCs进行纯化,采取PCGC从纯化的HTCs根据密度大小不同富集HCSCs。 3、正常肝边缘(side population from hepatic normal cells, SP-HNCs)分离 四氯化碳造就Fisher344大鼠的肝损伤模型,刺激肝内干细胞动员,制备正常肝细胞(hepatic normal cells, HNCs)的单细胞悬液。根据干细胞亚群具有主动外排染料特性,利用荧光激活的细胞分选术(fluorescence activatedcell sorting, FACS)富集边缘群(side population, SP)的方法分离SP-HNCs。 4、肝癌边缘细胞(side population from hepatic tumor cells, SP-HTCs)分离 根据CSCs亚群具有主动外排染料的特性,将HTCs和Hoechst33342染料共孵育,设定SP的范围所在,分离出SP-HTCs。 第二部分:HNSCs的扩增培养及诱导分化 1、建立FLSPCs的体外扩增体系 进行FLSPCs的有效扩增,并保持其处于未分化状态,我们将FLSPCs利用夹心法培养于上稀下密的双层软琼脂之间,同时添加白血病分化抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)。培养一段时间,以贴壁培养的FLSPCs作为参照,分析FLSPCs经过软琼脂扩增后,其干细胞特性是否发生变化。 2、建立FLSPCs的定向分化体系 单独添加不同浓度的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),找到促进FLSPCs分化为HNCs的最适宜DMSO浓度;单独添加不同浓度的肝细胞生长因子(hepatocellular growth factor, HGF),明确诱导FLSPCs分化为HNCs的最适宜HGF浓度;联合添加HGF和DMSO诱导FLSPCs分化,与单独诱导的效果对比,确定诱导FLSPCs分化的适合方案。 第三部分:HNSCs和HCSCs间的核酸差异谱 1、HNSCs和HCSCs间的miRNA差异谱 从SP-HNCs和SP-HTCs中分别分离总RNA。通过miRNA微阵列技术对比两种干细胞的miRNA表达差异,同时选取失调的代表性miRNAs,利用实时定量PCR技术验证失调表达的可靠性。以上调两倍、下调1/2作为失调的评判标准。 2、HNSCs和HCSCs间的基因差异谱 通过抑制性削减杂交技术对比SP-HNCs和SP-HTCs的基因表达差异,选取失调的代表性基因,利用实时定量PCR技术验证失调表达的可靠性。以上调两倍、下调1/2作为失调的评判标准。 第四部分:HNSCs向HCSCs的恶性转化 1、恶性转化模型的建立 从SP-HNCs和SP-HTCs间miRNA差异表达谱中挑选出在SP-HTCs下调幅度最大的miR-200a。利用RNAi技术干涉FLSPCs中miR-200a的表达。通过实时定量和原位杂交技术验证miR-200a的抑制效果。 2、恶性转化效果的验证 光学显微镜和透射电镜观察miR-200a抑制前后细胞的形态变化;流式细胞技术等检测细胞的增殖变化(包括细胞周期和细胞凋亡);划痕实验和Transwell技术检测细胞的侵袭、迁移能力变化;裸鼠皮下成瘤实验,观察miR-200a抑制前后细胞成瘤能力变化,以及细胞对受体肝脏的损害情况。 3、恶性转化的分子机制 利用常用miRNA-靶基因预测系统预测miR-200a参与调控的基因;与建立的HNSCs和HCSCs间基因差异谱对比,挑选出可能的靶基因;通过双荧光素酶报告系统和western blotting等技术,验证miR-200a调控的靶基因。 第五部分:MiR-200a与HCC发生的相关性分析 1、大鼠HCC模型的建立及阶段的划分 利用二乙基亚硝胺造就Fisher344大鼠HCC模型,根据病理学检测结果,将整个HCC发生过程分为六个阶段,依次为:正常肝阶段、变性肝阶段、纤维化阶段、肝硬化阶段、早期癌阶段、晚期癌阶段。 2、MiR-200a表达水平的检测 分别收集六个阶段的组织和血清标本,组织标本利用原位杂交技术检测miR-200a的表达,血清利用实时定量PCR技术检测miR-200a的表达水。 3、MiR-200a与病理资料的相关性分析 分析各阶段组织miR-200a表达水平与血清miR-200a表达水平之间的相关性;分析各阶段中miR-200a表达水平与病理评分之间的相关性。 【结果】 第一部分:HNSCs和HCSCs的分离鉴定 1、FLSPCs的三步分离法富集(此部分已入硕士论文) 三步分离法富集的FLSPCs是位于PCGC分离后第一、二层的细胞。这些细胞个头较小,具有较大的核/浆比,高表达干细胞标志CD133和CD49f,低表达成熟肝细胞标志,同时能够自行分化为表达ALB的类成熟肝细胞。 2、HCSCs的三步分离法富集(此部分与王兴硕士合作完成,详见其论文) 三步分离法富集的HCSCs是位于PCGC分离后第三层的细胞。这些细胞具有较大的核/浆比,高表达干细胞标志CD133和EpCAM,具有较强的体外增殖、侵袭、迁移、化疗耐药能力,体内移植该类细胞后其能快速在裸鼠皮下成瘤,同时迁移到肝脏形成肿瘤。 3、SP-HNCs的分离 SP-HNCs的比例约占HNCs的4%,这些细胞直径约为7-15μm,具有较大的核/浆比,高表达干细胞标志,低表达成熟肝细胞标志,能够被HGF诱导为表达ALB的类成熟肝细胞,体内移植SP-HNCs能修复鼠急性肝损伤。 4、SP-HTCs的分离 SP-HTCs具有较大的核/浆比,高表达干细胞标志,具有较强的体外增殖、迁移能力,HGF诱导能促使该类细胞分化为低表达干细胞标志的HTCs,体内移植该类细胞后其能快速在裸鼠皮下成瘤,同时迁移到肝脏形成肿瘤。 第二部分:HNSCs的扩增培养及诱导分化 1、建立FLSPCs的体外扩增体系 与贴壁培养的FLSPCs相比,双层软琼脂半悬浮培养的FLSPCs个头更小、具有更大核浆比、形成明显的碱磷的强阳性克隆;功能学方面:悬浮培养细胞稳定表达干细胞表面标志CD49f和CD90、高表达未成熟肝细胞标志AFP、低表达率成熟肝细胞标志ALB。 2、建立FLSPCs的定向分化体系 促进FLSPCs分化为HNCs的最适宜DMSO浓度为1%;HGF的最适宜诱导浓度为20ng/ml;与单独诱导对比,联合HGF和DMSO能更好地诱导FLSPCs分化。 第三部分:HNSCs和HCSCs间的差异谱 1、SP-HNCs和SP-HTCs间的miRNA差异谱 SP-HNCs和SP-HTCs间共有78个miRNAs存在失调表达,其中68个miRNAs在SP-HTCs中表达上调,10个miRNAs表达下调。 2、SP-HNCs和SP-HTCs间的基因差异谱 SP-HNCs和SP-HTCs间共有585个基因在SP-HTCs中显著失调,包括524个基因表达上调和61个基因表达下调。 第四部分:HNSCs向HCSCs的恶性转化 1、恶性转化模型的建立 通过实时定量PCR检测miR-200a的表达水平,抑制效果得到确认。由于miR-200a的抑制细胞增殖速度明显加快;Transwell实验证实细胞获取了较强的侵袭能力;裸鼠成瘤实验显示抑制后细胞的虽然在皮下未形成明显肿瘤,但是对肝脏造成了损害、甚至形成了肿瘤。 2、恶性转化的分子机制 靶基因预测显示,miR-200a可能参与调控了基因失调谱中ZEB的水平;miR-200a的抑制表达会导致ZEB在mRNA和蛋白表达水平的极度提升。 第五部分:MiR-200a与HCC发生的相关性分析 1、MiR-200a表达水平的变化趋势 组织中miR-200a的表达水平在肝纤维化阶段发生明显降低,而血清中miR-200a的表达水平则在肝硬化阶段发生明显下调。 2、MiR-200a与病理资料的相关性分析 组织中miR-200a表达水平与血清miR-200a表达水平在肝硬化阶段后呈现正相关;肝硬化阶段后miR-200a表达水平与病理评分之间呈正相关。 【结论】 第一部分:HNSCs和HCSCs的分离鉴定 三步分离法能够有效从胎肝中富集FLSPCs;三步分离法能够从原发HCC中成功富集HCSCs;SP分离法能够有效从正常肝中富集HNSCs;SP分离法能够从原发HCC中成功富集HCSCs。 第二部分:HNSCs的扩增培养及诱导分化 双层软琼脂半悬浮培养适合FLSPCs的自我更新;HGF+DMSO能够有效促进FLSPCs定向分化为成熟HNCs。 第三部分:HNSCs和HCSCs间的差异谱 SP-HNCs和SP-HTCs间存在多个失调miRNA和基因,这些失调分子可能是两种干细胞亚群间差异生物学特征的原因所在。 第四部分:HNSCs向HCSCs的恶性转化 MiR-200a的抑制表达能够促进FLSPCs发生恶性转化,该恶性转化过程可能通过调节其靶基因ZEB实现。 第五部分:MiR-200a与HCC发生的相关性分析 MiR-200a表达水平在肝硬化阶段即发生明显变化,并与HCC发生阶段密切相关,有望作为诊治的靶标。


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