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炎症因子和炎症小体在汉坦病毒感染致病中作用的初步研究

叶伟  
【摘要】:肾综合征出血热(hemorrhagic fever withrenal syndrome,HFRS)是由旧大陆汉坦病毒引起的,以急性肾功能损害为主要特征的急性传染病。该病自从被发现报道以来,我国发病人数一直位于世界首位,每年报告病例数万例以上,在我国的危害十分严重。目前,虽然已有灭活疫苗上市可供预防,但效果不佳,且临床上还缺乏特异有效的治疗药物,只能以支持治疗为主,因此HFRS至今仍是我国重点监控和防治的传染病。迄今HFRS的致病机制尚不完全清楚,但HFRS引起的血管渗透增加、急性出血进而引起休克等临床表现提示,HFRS与炎症因子诱导的血管通透增加之间存在联系。此外,HFRS发病迅速,与细胞因子风暴引起的疾病类似,即相关细胞因子的大量分泌和表达紊乱与疾病进展密切相关。另外,固有免疫通路中的炎症小体通路产生的IL-1β是一种强力的致热原,可以介导多种炎症反应。而HFRS的起病即是高烧,我们推测IL-1β等致热原可能在HFRS致病中起了一定作用。部分文献也支持此项观点,如有报道称HFRS病原体普马拉病毒(PUUV)可以感染单核/巨噬细胞,汉滩病毒(HTNV)可以感染树突状细胞等,而这两种细胞都可调节固有和适应性免疫应答,并可大量分泌细胞因子,在宿主免疫系统抗击病原的过程中起着十分重要的作用。此外,还有报道称,HFRS患者体内TNF-α等一系列细胞因子水平异常。有鉴于此,我们推测HFRS疾病进程中,炎症病理很可能起了十分重要的作用。 本研究首先检测了HFRS患者不同病期血浆标本中多种炎症因子的水平,之后利用实时定量PCR技术检测了HTNV76-118株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后,细胞中相关因子的mRNA水平;同时还检测了HUVEC在HTNV刺激下,内皮细胞中炎症小体相关成分的mRNA水平和培养上清中炎症小体通路产物IL-1β的水平,以初步明确炎症在汉坦病毒感染致病过程中所起的作用。 1. HFRS患者外周血浆炎症相关因子水平的检测 检测了141例HFRS患者外周血浆中VEGF、sVEGFR1、sVEGFR2、sVE-cadherin、IL-1β、S1P等相关炎症因子的表达情况,同时以30例健康成年人血浆标本为对照。检测结果显示,VEGF、sVE-cadherin等因子在疾病进程中的水平与对照组相比有明显的升高,且与疾病严重程度成正比。sVEGFR2的水平则与之相反,疾病的严重程度越高,其含量越低。健康人群中sVEGFR1基本检测不到,而在休克期患者血浆中则可检测到微量的sVEGFR1,提示其通路可能也在疾病中起了一定作用。在外周血浆中没有检测到IL-1β和S1P。 2. HTNV感染HUVEC后,细胞中相关炎症因子mRNA水平变化情况 以实时定量PCR检测了HUVEC在HTNV76-118株感染后不同时间段(6h、12h、18h、24h等)的细胞裂解液中S1P受体(S1P1和S1P2)、VEGF、VEGFR2、VE-cadherin等因子的mRNA水平。结果显示,VEGF、VEGFR2、S1P2的mRNA水平无明显变化,而S1P1和VE-cadherin等因子的mRNA水平在感染后期与感染早期相比有显著升高。 3. HTNV感染HUVEC培养上清中IL-1β水平的测定 以ELISA法检测了HTNV76-118株感染HUVEC后不同时间点细胞培养上清中IL-1β的水平。结果显示,在感染后早期(6h),相比未感染对照组,灭活的与未灭活的HTNV均可以刺激HUVEC产生更高水平的IL-1β;但随着时间的延长,IL-1β的水平在三个组别中的含量有了相反的变化,即HTNV感染组与灭活病毒对照组相比未感染对照组,其上清中IL-1β的水平很快下降并保持相对较低水平。说明HTNV的感染很可能是先激活炎症小体,随后又抑制了其通路的持续应答。 4. HTNV感染的HUVEC中炎症小体相关成分的检测 实时定量PCR结果显示,未灭活与灭活的HTNV感染HUVEC细胞的裂解液,与未感染对照相比,早期都有IL-1β分泌水平的上升,但随后又很快降为正常值。其他与炎症小体相关分子,如NLRP3、caspase-1、ASC等的水平则没有明显变化,说明这些成分的表达水平为常值,并不随病毒感染而有明显变化。未检测到IL-18,但IL-18结合蛋白(IL-18BP)水平的变化与IL-1β类似。Western Blot的结果也显示NLRP3和caspase-1等蛋白水平变化不明显。 以上研究结果表明,HFRS患者中VEGF通路相关炎症因子含量的变化与疾病进程的严重程度密切相关,佐证了炎症在HFRS致病中起到了一定的作用。汉坦病毒可能存在激活炎症小体通路的成分,而且可能是入胞前就刺激细胞产生炎症小体应答,并且在其入胞后不久又抑制宿主炎症小体的持续应答,但其具体原因和机制尚需进一步研究。


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