醛糖还原酶调节小胶质/巨噬细胞的极化及对脊髓损伤后运动功能恢复的影响

【摘要】：脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是一种导致重度瘫痪的疾病，且治疗和康复的难度极大，给个人、家庭和社会都带来沉重的精神压力和经济负担。到目前为止临床上还没有找到有效治疗SCI的方法或者药物。脊髓损伤后形成的局部环境不利神经元再生，是脊髓损伤难以治愈的主要原因之一。脊髓损伤后的炎症反应是脊髓损伤最为重要的病理过程，直接影响脊髓损伤后神经再生的内环境。小胶质/巨噬细胞是脊髓损伤后最为重要的炎症细胞，小胶质/巨噬细胞极化为M1或M2型细胞，是它们发挥不同生物功能的基础。M1型小胶质/巨噬细胞促进炎症发生，不利于神经轴突的再生；而M2型小胶质/巨噬细胞则抑制炎症发生，促进损伤组织的修复。醛糖还原酶（Aldose Reductase，AR）是糖代谢多元醇通路的关键限速酶之一，是体内葡萄糖转化为山梨醇的唯一酶。在高血糖的情况下，约有33%（Petrash，2004）的葡糖糖进入多元醇通路代谢，是产生糖尿病并发症的重要因素。最近研究发现AR还参与巨噬细胞的炎症反应，使用醛糖还原酶抑制剂（Aldose Reducase Inhibitor，ARI）后，可以抑制活化的巨噬细胞分泌促炎因子，减轻炎症反应。本硕士研究生课题是以AR为研究对象，通过体内和体外实验，重点研究AR在脊髓损伤后的时间变化和组织细胞分布情况；AR对脊髓损伤修复的作用、对脊髓损伤后的炎症反应影响，探讨AR对小胶质/巨噬细胞极化方向的影响及其分子机制。本研究由以下两部分实验组成： 实验的第一部分是脊髓损伤后AR的组织病理学研究以及AR对脊髓损伤后运动功能恢复的影响。该部分实验主要是应用AR~(+/+)小鼠，建立脊髓重度夹伤模型，分别选取假手术组，术后4h（小时）、8h、12h、1d（天）、3d、7d、14d等8个时间点。分别收集损伤中心上下各0.5cm的脊髓组织及组织提取物，分别进行AR的免疫荧光组织化学染色、QPCR、Western Blot等检测，观察脊髓损伤后AR的表达变化模式。此外，利用AR~(+/+)和AR-/-小鼠，观察AR对脊髓夹伤后运动功能恢复的作用。建立小鼠的脊髓重度夹伤模型，先期采用BBB运动学评分的方法（Basso，1996），来观察AR~(+/+)和AR-/-小鼠在损伤后的运动功能恢复情况，并作统计学分析。此外，选取术各组动物脊髓重度夹伤后3d、7d、14d等几个时间点，应用抗-GFAP免疫荧光组织化学染色方法，观察比较两组动物的损伤区面积的大小，并做定量的统计学分析。 实验第二部分则主要通过体内和体外研究，探讨AR对脊髓损伤后小胶质/巨噬细胞的极化作用和机制。同实验一的方法，建立AR~(+/+)和AR-/-小鼠的脊髓重度夹伤模型，选取假手术组、以及脊髓夹伤术后4h、1d、3d、7d、14d、21d等几个时间点，应用免疫荧光组织化学染色、QPCR、WesternBlot等方法，观察在mRNA和蛋白水平上，分别比较M1型和M2型细胞特异性标志分子，如诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）和精氨酸酶Ⅰ（ArginaseⅠ,ArgⅠ）的表达情况；同时观察相关信号分子NF-κB和CREB的表达情况。此外，利用N9小胶质细胞系，体外培养，给予不同的极化刺激以及联合ARI，观察M1和M2特异性标志分子的表达及相关信号分子的表达情况。 通过以上实验，我们发现在脊髓损伤后，AR在脊髓组织中表达上调，并在损伤后的第3天达到峰值。免疫组化研究显示：脊髓损伤后，AR主要在神经元和小胶质/巨噬细胞的表达上调。这一现象在体外培养的原代神经细胞中得到了验证。AR-/-小鼠脊髓损伤后，其运动功能的恢复要好于AR~(+/+)小鼠；且损伤后不同时间点上的损伤区面积也要小于AR~(+/+)小鼠。同AR~(+/+)小鼠相比，AR-/-小鼠脊髓损伤后，损伤区聚集更多的ArgⅠ阳性小胶质/巨噬细胞，而iNOS阳性细胞则较少。进一步发现，AR-/-小鼠在脊髓损伤后，M2型细胞特异性标志分子ArgⅠ和CD206的表达水平要远高于AR~(+/+)小鼠，而M1型细胞特异性标志分子iNOS和CD86的表达水平则低于AR~(+/+)小鼠。通过计算ArgⅠ/iNOS的比值分析，可以认为在AR-/-小鼠在脊髓损伤后，小胶质/巨噬细胞向M2方向极化。 体内研究发现，AR-/-小鼠脊髓损伤后，脊髓组织中的NF-κB表达较AR~(+/+)小鼠低；而检测CREB的结果发现，AR-/-小鼠在脊髓损伤要多于AR~(+/+)小鼠，同时，在活化的CREB的表达量上，AR-/-小鼠也要多于AR~(+/+)小鼠。同样通过体外培养N9小胶质细胞系，给予不同的极化刺激并联合ARI处理，结果发现ARI可以抑制iNOS的表达，促进ArgⅠ的表达，同时可以促进CREB的表达。 通过上述研究发现：在AR缺失的情况下，可以促进小胶质/巨噬细胞向M2型细胞方向极化，从而促进脊髓损伤后的运动功能恢复；因此，AR可能激活通过NF-κB通路，促进小胶质/巨噬细胞向M1方向极化，而通过抑制CREB，阻止小胶质/巨噬细胞向M2方向极化。