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二苯乙烯苷通过激活PI3K/Akt通路对MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的神经保护作用

张玲玲  
【摘要】:帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要的病理学特征为中脑黑质(Substantia nigra, SN)多巴胺能(Dopaminergic,DAergic)神经元进行性的丢失,伴随纹状体多巴胺(Dopamine, DA)含量明显下降。PD的病因不明,但研究表明氧化应激和线粒体功能障碍在其发病机制中起重要作用。目前治疗PD的主要药物是左旋多巴类制剂,但其疗效随着病程的进展明显下降。研究发现许多中草药及其提取物具有神经保护作用,在延缓或防止PD进展中显示出潜在的临床效益。 何首乌,是一种传统的中草药,在中国古代作为一种补益和抗衰老的药物而被广泛使用。我们在临床中发现以何首乌为“君药”的方剂治疗PD确实有一定疗效。有报道显示何首乌的可溶性提取物(PME-Ⅰ)具有神经保护作用,可以减轻神经毒素诱发的DAergic神经元损伤,改善PD小鼠的行为学。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)为PME-Ⅰ的主要活性成分,研究发现其具有抗氧化,抗炎,抑制氧化应激等作用。 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropy-ridine, MPTP)的活性代谢产物MPP+可以选择性的损伤DAergic神经元,造成纹状体DA衰竭,在猴子和小鼠中可以产生出类似于原发性PD的症状。我们最近的研究证实TSG可以减轻MPP+诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/Akt通路有关。为了进一步探讨TSG在动物体内的作用效果及其机制,我们选取MPTP亚急性损伤C57BL/6小鼠作为PD实验模型,首先观察了不同剂量的TSG干预后对该模型的行为学和神经组织学的影响,进一步探讨了TSG发挥神经保护作用的可能机制:是否通过激活PI3K/Akt通路。 【目的】 1.制备MPTP亚急性损伤PD小鼠模型。 2.观察TSG对MPTP诱导的PD小鼠的行为学及神经组织学的影响。 3.探讨TSG是否通过激活PI3K/Akt通路对MPTP诱导的PD小鼠发挥神经保护作用。 【方法】 1.动物分组和模型制备:实验动物随机分为4组。A组:正常生理盐水对照组,腹腔注射生理盐水0.3ml,1次/d,连续14d;B组:模型组,腹腔注射MPTP(30mg/kg,生理盐水溶),1次/d,连续7d,后腹腔注射等体积生理盐水,1次/d,连续7d;C组和D组为TSG干预组,给药方式为:MPTP(30mg/kg)腹腔注射,连续7d,1h后分别给予TSG(20mg/kg)或(40mg/kg)灌胃1次/d,连续14d,在实验二中加E组,MPTP(30mg/kg)腹腔注射,连续7d,1h后给予TSG (40mg/kg)和LY294002(3.75mg/kg)灌胃,1次/d,连续14d。每天上午9:00~10:00给药,用爬杆实验和悬挂实验观察小鼠的行为学变化。 2.给药后第14d,每组随机选取10只小鼠取脑制作冰冻切片,采用免疫荧光组织化学方法观察TSG对MPTP诱导的小鼠SN酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运体(DAT)阳性神经元数目的影响。3.采用蛋白质印迹法(Western blotting)分别检测各组小鼠纹状体中TH,DAT, Akt, p-Akt(ser473), GSK3β, p-GSK3β(ser9), BAD, Bcl-2, caspase-9和caspase-3的蛋白质表达情况。 【结果】 1.行为学检测结果显示:爬杆实验中,与正常生理盐水对照组相比,模型组小鼠Tturn和TLA时间指数明显延长,表明其出现了运动协调缺损。分别给予不同剂量的TSG (20,40mg/kg)可以改善Tturn时间指数的延长(P0.05),但对改善其TLA时间指数的延长呈一定的剂量依赖性(P0.05, P0.01)。悬挂实验中,模型组小鼠两后肢均不能抓住细线,悬挂能力与正常对照组相比显著下降(P0.01),而重复给予不同剂量的TSG可减轻此症状,其作用呈一定的剂量依赖性(P0.05, P0.01)。 2.免疫荧光染色清晰地显示:TH和DAT阳性细胞主要分布于黑质致密部(Substantia nigra pars compacta, SNpc),免疫荧光双标记表明TH与DAT共存。MPTP处理可引起TH和DAT阳性细胞数量明显下降,而TSG干预具有保护效应。统计学结果表明:与生理盐水对照组相比,模型组小鼠TH阳性细胞数目明显减少到34.2±2.77(P0.01),DAT阳性细胞相应减少到32.2±1.89(P0.01),低剂量的TSG(20mg/kg)干预后TH和DAT阳性细胞分别升高到45.8±2.06,39.4±0.98(P0.05),而高剂量的TSG(40mg/kg)干预后,TH和DAT阳性细胞显著升高到67.3±2.79,67.3±2.11(P0.01)。 3. Western blotting方法检测结果表明,与模型组小鼠相比,给予不同剂量的TSG后可以增加其纹状体TH和DAT蛋白的表达,此外,还可以提高纹状体Akt和GSK3β的磷酸化,上调Bcl-2/BAD比值,抑制caspase-9和caspase-3的活化。 【结论】 1. TSG以剂量依赖的方式改善PD小鼠的行为学,减轻MPTP对小鼠黑质DAergic神经元的损伤。 2. TSG对MPTP亚急性损伤PD小鼠的神经保护作用机制可能涉及PI3K/Akt通路。


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