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免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid的基因构建、表达及对HBsAg阳性肝细胞癌的杀伤作用

闫博  
【摘要】:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,手术治疗复发率高,传统放、化疗对正常组织毒害大,本组建立的免疫促凋亡策略已经在HER2肿瘤模型中证实具有明确的抗肿瘤作用,该策略靶向性高、副作用小,有希望推广应用于HCC的抗肿瘤治疗。关键问题是首先获得能够特异地识别HCC肿瘤标志物的单链抗体,以此抗体构建免疫促凋亡分子,使之靶向杀伤HCC肿瘤细胞。 本课题组曾从噬菌体抗体库筛选、改造获得一株对HBsAg具有亲和活性并可经由内吞体进入HBsAg阳性肿瘤细胞的人源性单链抗体(scFv15),并证实了由scFv15/鱼精蛋白构成的重组分子能够将小核酸类效应分子特异地输送到HBsAg阳性肝癌细胞中,发挥抗病毒效应,为将该单链抗体用于构建靶向HBsAg的免疫促凋亡分子提供了有力的实验依据。 靶向HBsAg的免疫促凋亡分子由三部分组成:特异识别HBsAg的scFv15、转位结构域和促凋亡分子。免疫促凋亡分子由scFv15介导靶向进入HBsAg阳性肝癌细胞后,其抗肿瘤作用的强弱取决于两个要素。 第一个要素是促凋亡分子必须经过优化,具有尽可能强的细胞凋亡诱导效应。本课题组曾筛选比较了caspase-3、caspase-6、granzyme B、AIF、tBid等多种人体自身促凋亡分子,体内外实验证实,tBid具有分子量小、渗透性强、诱导凋亡时效短、促凋亡效应强等优点,因此本研究采用tBid作为促凋亡效应分子。 第二个要素是免疫促凋亡分子必须能够从内吞体转位进入胞浆,具有尽可能高的内吞体转位效率。这是因为免疫促凋亡分子内化进入肿瘤细胞后,包裹于内吞体中,必须从内吞体转位释放到胞浆,才能发挥杀伤效应。免疫促凋亡分子的转位过程包括两步:一是内吞体中的Furin蛋白酶切割免疫促凋亡分子,使单链抗体部分与促凋亡分子分离;二是内吞体膜被破坏,促凋亡分子释放到胞浆。 我们以往的研究已经对转位的两步骤进行了优化:第一步的优化结果显示,白喉毒素的Furin识别序列(Fdt)的切割效率最高;第二步的优化结果显示,流感病毒血凝素蛋白中的HA2序列破坏内吞体膜的能力最强,但HA2序列在融合蛋白中所处的位置是否影响其转位功能尚不清楚。 本研究首先观察了HA2序列的位置与转位功能的关系。将HA2序列分别融合于scFv15的N端和C端,只有HA2-scFv15能够破坏内吞体膜,使标记FITC的指示分子弥散性分布于胞浆,因此本研究选择将HA2融合于效应分子的N端。 基于上述实验结果,本研究将scFv15、Fdt、HA2、tBid四部分融合表达,构建靶向HBsAg的免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid。该分子具有Fdt序列,可在内吞体中经Furin蛋白酶切割,将HA2暴露于多肽链N末端,进而破坏内吞体膜,释放tBid进入胞浆发挥杀伤效应。构建不含HA2序列的免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-tBid作为对照。 体外实验表明,scFv15-Fdt-tBid和scFv15-Fdt-HA2-tBid都具有良好的抗原靶向性,可以特异性结合HBsAg阳性肿瘤细胞;融合有HA2序列的scFv15-Fdt-HA2-tBid分子较scFv15-Fdt-tBid能更快速的突破内吞体限制,转位进入胞浆。scFv15-Fdt-tBid和scFv15-Fdt-HA2-tBid对HBsAg阴性细胞无明显毒性,但能通过诱导凋亡显著降低HBsAg阳性肿瘤细胞存活率,且scFv15-Fdt-HA2-tBid的作用更强。免疫促凋亡分子的促凋亡效应与线粒体凋亡通路的激活有关,伴随着线粒体膜电位降低,caspase-9和caspase-3的活化。 体内实验表明,经尾静脉注入肝原位荷瘤裸鼠体内的免疫促凋亡分子,能够逐渐向肿瘤所在位置富集,对其他正常组织脏器的累积分布较少,证明免疫促凋亡分子具有良好的在体靶向性及组织渗透性。免疫促凋亡分子治疗后,瘤体增长速度均显著减缓;相对于scFv15-Fdt-tBid,scFv15-Fdt-HA2-tBid具有更强的肿瘤增殖抑制作用,能够更高效地诱导肿瘤细胞发生凋亡。 以正常Balb/c小鼠对scFv15-Fdt-HA2-tBid进行在体安全性检测,10倍剂量仍未表现出对重要脏器的损伤作用,没有引起明显的炎症反应,提示scFv15-Fdt-HA2-tBid具有良好的体内应用安全性。 综上所述,免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid在体内外均可以靶向结合HBsAg阳性肿瘤细胞,具有较强的特异性和良好的渗透性;HA2序列的引入可以促进凋亡效应分子向胞浆释放,显著提高诱导肿瘤细胞凋亡的效率;该分子安全性较好,并且对人体的潜在免疫原性低,对于HBV相关HCC的治疗具有重要的应用价值。


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