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Notch信号通路参与肝癌细胞侵袭迁移的机制研究

周亮  
【摘要】:原发性肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是常见的致死性恶性肿瘤之一,虽然各种治疗方法不断改进,但是该疾病的死亡率仍高居不下,究其原因主要是肝癌的复发及肝内外转移。所以针对肝癌转移机制的研究也成为目前的热点之一,也为肝癌的治疗提供了新的思路。肝癌细胞转移,最主要就是侵袭和迁移的过程,主要包括:肝癌细胞活动性增强,细胞之间粘附性降低,肝癌细胞从原发灶脱离后穿过细胞外基质及血管壁的基底膜,进入脉管循环,在这个过程中肝癌细胞还能促进血管的形成。而在这个过程中许多分子参与其中,如Fascin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9及VEGF。Notch信号通路是一种经典的信号通路,该通路的家族成员在结构上具有高度的保守性。一般传统上认为Notch信号通路主要参与了生物个体的发育及组织的再生。随着对Notch信号通路的研究不断深入,发现该通路不仅参与了生物个体的发育过程,还参与肿瘤的不同发生、发展过程。目前国内外有关Notch信号通路在肝癌中的作用机制报道较少。尤其是关于其在肝癌转移中的作用及机制尚不清楚。 本实验采用不同的肝癌细胞系,通过Notch信号通路的阻断剂来处理细胞,从细胞骨架改变、细胞迁移、细胞侵袭三个方面探讨了Notch信号通路参与肝癌细胞侵袭迁移的机制。结果提示Notch信号通路能够在上述三个方面,通过调控不同的分子发挥作用。本研究补充了Notch信号通路在肝癌中的作用机制,为阐明肝癌的转移机制奠定基础。 实验一:Notch信号通路在肝癌细胞中的状态及阻断Notch信号通路对肝癌细胞侵袭迁移的影响。 目的:探讨Notch信号通路在肝癌细胞中的状态及阻断Notch信号通路对肝癌细胞侵袭迁移的影响。方法:Transwell小室检测细胞的侵袭和迁移能力;RT-PCR的方法检测了Hes1、Hes5、Hey1的mRNA表达;Western Blot的方法检测了N1ICD的蛋白表达;MTT和细胞计数的方法检测了细胞的增殖;DAPT阻断Notch信号通路。结果:Hes1、Hes5、Hey1及N1ICD在肝癌细胞中高表达,与细胞的侵袭迁移能力呈正相关;1μmol/L和5μmol/L浓度的DAPT能够有效抑制Notch信号通路,并且不影响肝癌细胞的增殖,但能够抑制细胞的侵袭和迁移。结论:Notch信号通路在肝癌细胞系中成激活状态,并随着细胞侵袭迁移能力的增加而增加,阻断Notch信号通路后,肝癌细胞的侵袭迁移能力下调。 实验二:阻断Notch信号通路改变肝癌细胞骨架的机制研究。 目的:探讨Notch信号通路在调控肝癌细胞骨架中的作用机制。方法:免疫荧光和扫描电镜的方法检测了细胞的骨架和伪足变化;Western Blot的方法检测了Fascin的蛋白表达;采用DAPT阻断Notch信号通路。结果:1μmol/L和5μmol/L浓度的DAPT能够有效抑制肝癌细胞骨架和伪足的形成,并且抑制了Fascin的表达。结论:阻断Notch信号通路后,肝癌细胞的骨架结构发生改变,伪足减少,其机制可能是通过调控细胞骨架蛋白Fascin来发挥作用的。 实验三:阻断Notch信号通路降低肝癌细胞迁移能力的机制研究。 目的:探讨Notch信号通路在肝癌细胞迁移中的作用机制。方法:Transwell小室检测细胞的迁移能力;RT-PCR的方法检测了Snail和E-cadherin的mRNA表达;采用Western Blot的方法检测了Snail、E-cadherin及COX-2的蛋白表达;siRNA的方法干涉了Snail的表达;DAPT阻断Notch信号通路,NS-398阻断了COX-2;采用了PGE2模拟了COX-2的作用。结果:Snail和E-cadherin参与了肝癌细胞的迁移过程,并且Snail能够调节E-cadherin的表达。DAPT能够上调E-cadherin,下调Snail和COX-2。PGE2能够逆转DAPT对Snail/E-cadherin的调控作用;在肝癌细胞迁移过程中DAPT和NS-398起到了相同的作用,而PGE2能够逆转DAPT对肝癌细胞迁移的抑制作用。结论:Notch信号通路可能是通过调控COX-2/Snail/E-cadherin通路调控肝癌细胞的迁移过程。 实验四:阻断Notch信号通路降低肝癌细胞侵袭能力的机制研究 目的:探讨Notch信号通路在肝癌细胞侵袭中的作用机制。方法:Transwell小室检测了细胞的侵袭能力;Western Blot的方法检测了MMP2、MMP-9、VEGF、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达;ELISA检测了MMP2、MMP-9、VEGF、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白活力;siRNA的方法干涉了MMP2、MMP-9、VEGF的表达;DAPT阻断Notch信号通路,PD98059阻断了ERK1/2。结果:MMP2、MMP-9和VEGF参与了肝癌细胞的侵袭过程;DAPT能够下调MMP2、MMP-9、VEGF和磷酸化ERK1/2的表达和活力;在肝癌细胞侵袭过程中DAPT和PD98059起到了相同的作用。结论:Notch信号通路可能是通过调控ERK1/2/MMP2、MMP-9、VEGF通路调控肝癌细胞的侵袭过程。 综上所述,本实验从多个方面证实了Notch信号通路在肝癌细胞侵袭转移中的作用,提示Notch信号可以通过多通路、多靶点参与肝癌细胞的侵袭转移过程。这一研究为揭示肝癌侵袭转移的机制奠定了理论基础,并为肝癌的临床治疗提供新的思路。


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