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干细胞对小鼠涎腺放射损伤的预防实验研究

王艳  
【摘要】:【背景】 唾液是人体生存所不可缺少的,由人体涎腺所分泌,它能帮助人体消化食物,杀菌、清洁和保护口腔。然而对于头颈部恶性肿瘤患者,大部分要接受放疗,而涎腺也位于头颈部,这就不可避免的造成涎腺细胞不可逆性放射损伤,导致其分泌功能降低或丧失,给患者带来极大的困扰,目前防止涎腺损伤的方法也只能是尽量减少腺体受到照射。而对于涎腺区肿瘤,部分放射损伤是不可避免的,目前在临床上对于涎腺损伤尚没有根本性的治疗措施,如何从根本上预防涎腺放射损伤,为病人解决痛苦呢,这成为目前广大学者及医生的难题。随着组织工程研究的日益丰富,涎腺组织工程技术也逐渐发展起来,种子细胞是组织工程的重要因素,涎腺细胞属于成熟的终末分化细胞,不能无限增殖,对于涎腺损伤的患者涎腺干细胞提取困难,随着干细胞的多向分化潜能逐渐被发掘出来,其他来源的成体干细胞能否也应用于涎腺损伤的研究呢?因此本实验探讨用脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ASCs)及骨髓干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)来预防涎腺放射损伤,研究其作用机制,为临床预防患者口干症状提供一种新的思路。 【目的】 探讨干细胞预防涎腺放射损伤的可行性,为应用于临床预防放疗患者口干症状提供实验依据。 【方法】 1.从雄性小鼠中分离培养脂肪干细胞(ASCs)及骨髓干细胞(BMSCs),通过活细胞照相及HE染色,细胞成脂和成骨诱导分化,细胞生长曲线测定,以细胞表面CD分子测定,对干细胞特性进行鉴定。 2.小鼠涎腺放射损伤模型的建立。将雌性小鼠分为6组,每组10只,瓦里安直线加速器分别进行对每组小鼠给予0Gy,12Gy,15Gy,18Gy,21Gy,24Gy进行头颈部局部照射,照射后一月内观察小鼠体重变化,照射后一周,一个月进行血象分析,照后2,3,4月进行唾液流量测定,组织切片HE染色,透射电镜观察组织超微结构,TUNEL法细胞凋亡检测。 3.干细胞预防小鼠涎腺放射损伤实验。分为四组,对照组(control),照射+生理盐水(IR+NS),照射+脂肪干细胞(IR+ASCs),照射+骨髓干细胞(IR+BMSCs)。选取两种第三代干细胞对照射后各组小鼠立即进行尾静脉注射,每周两次,每次注射细胞浓度为2×105/ml,每次注射0.2ml,连续注射8周,注射后8周进行检测指标。 4.各组小鼠的涎腺功能测定:包括体重测量,腺体重量测量,唾液流量的测定。 5.各组小鼠的涎腺组织形态学观察,包括HE染色,PAS染色,透射电镜观察组织超微结构,TUNEL法细胞凋亡检测组织损伤情况。 6.统计学分析方法,采用SPSS19.0软件,采用ANOVA单因素方差分析法和t检验对上述采集的数据进行各组间统计分析,比较各组间有无统计学差异。 【结果】 1.从小鼠体内分离培养的ASCs,形态呈梭形,具有较强的增殖能力,能表达脂肪干细胞CD29、CD44和CD90,不表达CD31、CD34和CD45,能向成脂细胞和成骨细胞分化能力,表明实验成功培养出ASCs。 2.用全骨髓法成功从小鼠体内培养出骨髓间充质干细胞,细胞形态呈梭形,多边形,三角形及不规则形,细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达CD31、CD34和CD45,,有向成脂及成骨分化的潜能,有自我更新和增殖能力,但没有脂肪干细胞增殖能力强。 3.照射组小鼠在照射后体重轻微下降,血常规各项较对照组下降,唾液流量率较对照组有明显下降,而且随时间延长,照射剂量越大,降低幅度也越大,各照射组的唾液流量与未照射组相比有明显差异。 4.组织切片HE显示照射组颌下腺组织较对照组有明显损伤,腺泡细胞数量减少,结构紊乱,剂量越大,损伤越明显;电镜下可见腺泡细胞水肿变性坏死,细胞结构紊乱;凋亡检测可见照射组组织大量凋亡细胞,18Gy照射组的凋亡率为21±2.5%,正常组织凋亡细胞几乎为0。 5.干细胞注射后8周,进行指标检测,IR+ASCs组,IR+BMSCs组较IR+NS组在小鼠体重、腺体重量及唾液流量上都稍增加,但较未照射组偏低,IR+ASCs组较IR+BMSCs组稍增加,各组之间有明显统计学差异。 6.细胞注射后8周,不同组的HE染色结果显示:照射组腺泡细胞数量较未照射组减少,各组之间有统计学差异,注射细胞组较注射NS组细胞数量稍增加。 7. PAS染色同样可见照射组较对照组组织切片染色较浅,而IR+注射细胞组较IR+NS组颜色稍深,可见照射组腺泡细胞的糖原明显减少,而注射细胞组较注射NS组糖原成分稍增加。 8.透射电镜观察组织超微结构显示:对照组细胞形态正常,细胞器结构完好,而IR+NS组细胞水肿,细胞器破坏最严重,结构消失,溶酶体明显增加,注射细胞组细胞形态基本正常,能见到新生的小血管。 9.各组织细胞凋亡检测:从各凋亡切片可见:对照组几乎为0,IR+NS组凋亡最明显,凋亡指数为:38±2.3%,IR+ASCs组的凋亡指数为23±1.8%,IR+BMSCs组凋亡指数为28±2.1%,注射细胞能降低照射后组织的细胞凋亡率,差异有明显统计学意义(P0.05)。 【结论】 1.从小鼠体内可以成功分离出脂肪干细胞及骨髓间充质干细胞,具有多向分化潜能,实验证明骨髓间充质干细胞没有脂肪干细胞增殖能力强。 2.颌下腺放射损伤有剂量依赖性,照射后两个月,18Gy照射组组织切片有大量炎性细胞浸润,与正常对照组相比,放射组小鼠下颌下腺的唾液流量降低接近正常组的60%,是研究涎腺放射损伤的理想的放射模型。 3.照射后注射干细胞组的涎腺组织无论在功能上和形态学上都可以减少涎腺放射损伤,但尚不能达到正常水平,ASCs比BMSCs在防止涎腺损伤上更有效,各组之间有明显统计学意义。


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