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趋化因子CCL5及其受体CCR5在唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭中的作用和意义

申志远  
【摘要】:唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是一种较少见的恶性肿瘤,嗜神经侵袭被看做是它的主要特性之一,这一特性使得其在临床手术中不易切除干净,致使癌细胞残留,导致了术后肿瘤的复发,这给临床治疗带来了极大的困难,因此,探寻唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭的生物学标记物并对其机制进行深入研究具有重要的临床意义。趋化因子与肿瘤的关系已经成为人们日益研究的热点,但是趋化因子与唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭的研究报告目前还较少,尤其是趋化因子CCL5和其受体CCR5在唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭中的作用,目前国内外尚未见报告。 目的: 1、研究趋化因子受体CCR5在唾液腺腺样囊性癌发生和发展中的可能作用及意义;2、研究分析趋化因子受体CCR5的表达水平与唾液腺腺样囊性癌的病理分型和其引起的肿瘤性疼痛之间的相关关系; 3、研究趋化因子受体CCR5在唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83中是否为功能性受体,并研究CCL5/CCR5生物轴对唾液腺腺样囊性癌细胞SACC-83的运动性、趋化性、侵袭性和增殖效应的影响; 4、研究CCR5受体阻断剂Maraviroc对唾液腺腺样囊性癌细胞SACC-83的运动性、趋化性、侵袭性和增殖效应的影响。 方法: 1、利用免疫组织化学法(SP法)对32例人唾液腺腺样囊性癌临床标本和38例人正常唾液腺临床标本进行趋化因子受体CCR5的免疫组织化学染色,并应用统计学的方法分析受体CCR5的表达水平与唾液腺腺样囊性癌的病理分型和其引起的肿瘤性疼痛之间的相关关系。 2、利用免疫组织化学的方法(SP法)对32例临床唾液腺腺样囊性癌标本和20例临床正常周围神经组织标本分别进行受体CCR5和配体CCL5的免疫组织化学染色,观察两者的表达情况; 3、利用细胞免疫化学、细胞免疫荧光和流式细胞仪技术检测人唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83是否表达CCR5受体; 4、利用MTT增殖实验观察CCL5/CCR5生物轴对SACC-83细胞增殖效应的影响; 5、细胞水平上,利用划痕、趋化和侵袭实验观察CCL5/CCR5生物轴对SACC-83细胞的运动性、趋化性和侵袭性的影响; 6、亚细胞水平上,利用流式细胞仪技术观察CCL5/CCR5生物轴对SACC-83细胞内钙离子浓度变化的影响;利用激光共聚焦显微镜观察CCL5/CCR5生物轴对SACC-83细胞内肌动蛋白聚合重排的影响。 结果: 1、受体CCR5在32例腺样囊性癌标本中的阳性表达率为93.8%(30/32),在正常唾液腺组织的腺泡组织中无表达,在腺管组织中呈强阳性着色;配体CCL5在外周正常神经组织和唾液腺腺样囊性癌侵袭的神经组织内呈阳性高表达。 2、受体CCR5的表达水平与唾液腺腺样囊性癌的病理分型不相关,与其引起的临床肿瘤性疼痛呈正相关关系。 3、细胞免疫化学、细胞免疫荧光和流式细胞术实验证实唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83有受体CCR5的表达,说明SACC-83细胞可以用作研究CCL5/CCR5生物轴的体外细胞。 4、在MTT增殖实验中,加入CCL5孵育48h后,可以观察到不同浓度的趋化因子CCL5对SACC-83细胞的增殖有明显的促进作用,当CCL5的浓度为100ng/ml时,细胞的增殖活性达最大值;而加入阻断剂Maraviroc将受体CCR5阻断后,细胞的增殖效应明显受到抑制。 5、体外划痕实验中,相同时间内,加入趋化因子CCL5组与空白组相比较,SACC-83细胞的运动性明显增加;体外趋化和侵袭实验中,不同浓度的趋化因子CCL5均促进了SACC-83细胞的趋化性和侵袭性,并且对趋化因子CCL5有明显的浓度依赖性,当CCL5的浓度为20ng/ml时,穿越聚碳酸酯膜的细胞数达最大值。而受体阻断剂Maraviroc将受体CCR5阻断后,穿越聚碳酸酯膜的细胞数明显减少。 6、流式细胞仪跟踪观察,加入趋化因子CCL5后,SACC-83细胞内的钙离子浓度有一个瞬时的增高,而用受体CCR5阻断剂Maraviroc阻断CCR5后,即使加入趋化因子CCL5,细胞内的钙离子浓度也没有明显的变化;应用CCL5预处理SACC-83细胞后,在激光共聚焦显微镜下可观察到在细胞边缘有明显的肌动蛋白聚合重排现象,并可见到细胞周围有明显的伪足伸出,而利用特异性的受体阻断剂Maraviroc将受体CCR5阻断后,以上现象则受到明显抑制。 结论: 1、免疫组织化学实验中,趋化因子受体CCR5在唾液腺腺样囊性癌的切片标本中呈阳性表达,在正常唾液腺腺泡细胞中无表达,在腺管组织中呈强阳性表达,提示CCR5可能与唾液腺腺样囊性癌的发生和发展密切相关,并且有可能成为唾液腺腺样囊性癌癌变的标记物之一。 2、受体CCR5的表达水平与唾液腺腺样囊性癌的病理分型不相关,与其引起的临床肿瘤性疼痛呈正相关关系,提示CCL5/CCR5生物轴可能与唾液腺腺样囊性癌患者的肿瘤性疼痛密切相关。 3、体外细胞实验,首次发现趋化因子CCL5与其受体CCR5结合后,可以促进唾液腺腺样囊性癌细胞SACC-83的运动性、侵袭性、趋化性和增殖效应,提示两者的结合在唾液腺腺样囊性癌周围神经侵袭的过程中可能扮有重要的角色。 4、亚细胞水平实验,发现CCL5/CCR5生物轴引起了SACC-83细胞内钙离子跨膜转运及细胞内肌动蛋白的聚合重排,提示CCL5与CCR5的结合为功能性结合,两者的结合引起的细胞内钙离子浓度的增高及细胞内肌动蛋白的聚合重排可能是促进SACC-83细胞侵袭性和运动趋化性的基础。 5、CCR5受体阻断剂Maraviroc对SACC-83细胞的运动性、趋化性、侵袭性和增殖效应有明显的抑制作用,并且可以明显的阻断细胞的钙离子跨膜转运及肌动蛋白的聚合重排,提示Maraviroc可能是一种新的靶向抗肿瘤药物,小分子剂量的临床应用可能会抑制唾液腺腺样囊性癌的侵袭和发展。


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