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PIM-1基因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖能力和增殖周期的调控作用研究

艾世宜  
【摘要】:背景 心肌梗死(Myocardial Infarcion,MI)是引起缺血性心肌病(IschemicCardiomyopathy,ICM)产生心力衰竭(Heart Failure,HF)的主要病因之一,严重影响人类的健康水平和生活质量。近年来研究发现,心肌梗死后部分心肌细胞仍可以进行分裂增殖,但是每年的更新率仅为1%,不能弥补梗死区域损失的心肌细胞数量[1]。目前,临床上MI的治疗方法均无法挽救已经坏死的心肌细胞。随着对干细胞研究的进一步深入,发现将干细胞诱导分化为心肌细胞后移植到心梗区域能够促进心肌细胞再生从而改善心功能,这一研究发现为MI的治疗带来了新的希望。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem cells,BMMSCs)因具有多向分化潜能、高效的自我更新能力以及取材容易等特性已经成为干细胞的研究热点,然而,BMMSCs在体外长期培养时出现的衰老问题限制了其在临床治疗中的应用。近期研究发现,PIM-1是Akt信号通路中重要的下游调节因子,广泛的参与细胞增殖、细胞分化、凋亡等生理过程,具有提高细胞增殖能力的生物学作用。但PIM-1对BMMSCs增殖能力的调控作用和对细胞增殖周期的影响尚不清楚。 目的 (1)研究大鼠BMMSCs体外分离培养的方法以及各代BMMSCs的增殖规律。 (2)探讨PIM-1对大鼠BMMSCs增殖能力和凋亡的影响。 (3)探索PIM-1对大鼠BMMSCs衰老的调控作用。 方法 (1)大鼠BMMSCs的分离培养与鉴定:采用密度梯度离心法联合差速贴壁法分离培养大鼠BMMSCs,传代以纯化细胞,用流式细胞仪鉴定第4代(P4) BMMSCs表面抗原。应用倒置光学显微镜观察各代BMMSCs的形态学特征。 (2)BMMSCs的转染:将P4BMMSCs接种于24孔板中,分为空白对照组(BMMSCs组),egfp转染组(BMMSCe组)和PIM-1-egfp转染组(BMMSCep组),每组细胞设3个复孔,分别将Lv-egfp转入BMMSCe组,将Lv-egfp-PIM-1转入BMMSCep组。 (3)PIM-1基因和TERT基因的表达检测:采用实时荧光定量PCR法分别检测P4BMMSCep组和P9BMMSCep组中PIM-1基因表达水平和P9BMMSCep组中TERT基因的表达水平,应用2(-△△ct)法分析。应用Western Blotting法检测转染后PIM-1蛋白的表达水平并进行半定量分析。 (4)细胞增殖能力和细胞周期的检测:采用MTT法检测各代BMMSCs的细胞增殖能力和经PIM-1转染后细胞增殖能力的变化并绘制细胞增殖曲线。采用流式细胞仪技术检测各代BMMSCs的细胞周期及经PIM-1转染后细胞周期的变化。 结果 (1)BMMMSCs的形态学变化及鉴定:原代细胞体积小,形态多变,呈梭形或星形,可见细胞突起从胞质内伸出。P3~P9BMMSCs细胞形态发生明显改变,P3BMMSCs细胞排列紧密,呈长梭形,形态均一;P9BMMSCs细胞胞体明显增宽,长梭形形态消失,细胞内出现空泡。流式细胞仪鉴定BMMSCs表面抗原的结果显示,CD29表达率为(96.2±2.1)%,CD44表达率为(94.2±3.2)%,CD45表达率为(2.1±1.3)%。 (2)BMMSCs细胞增殖规律及细胞周期的检测: P3~P9BMMSCs组的细胞生长曲线均呈S形。在第1d~2d处于潜伏期,细胞生长缓慢;在第3d~5d时,细胞进入对数生长期,增殖加速;至第6d时,细胞增殖速度减慢,P3、P5、P7、P9BMMSCs细胞光吸收值分别为:0.591±0.132、0.560±0.179、0.527±0.164、0.458±0.121,说明P3~P5细胞增殖良好,P9细胞增殖不良(P 0.05)。细胞周期检测结果显示,随着传代次数的增加处于增殖期的细胞比例下降,P9中处于增殖期的细胞比例最低(P 0.05)。说明BMMSCs在体外培养时,随着传代次数的增多,细胞增殖能力逐渐降低,当传至第9代时,BMMSCs进入衰老状态。 (3)PIM-1对大鼠BMMSCs增殖能力和凋亡的影响:应用慢病毒介导的PIM-1转染P4BMMSCs后,BMMSCs组、BMMSCep组和BMMSCe组中PIM-1基因的表达量分别为(0.71±0.065)bp、(1.40±0.198)bp和(0.72±0.105)bp,BMMSCep组中PIM-1基因的表达量显著高于BMMSCs组和BMMSCe组(P 0.05)。Westernblot及半定量分析结果显示,BMMSCep组中PIM-1蛋白的表达水平显著高于BMMSCs组和BMMSCe组(P 0.05)。在6d时,BMMSCs组、BMMSCe组和BMMSCep组吸光度值分别为0.52±0.029、0.54±0.041、0.72±0.031,BMMSCep组的细胞增殖能力显著高于BMMSCs组和BMMSCe组(P 0.05),说明PIM-1能够显著提高BMMSCs的增殖能力。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,BMMSCs组、BMMSCe组及BMMSCep组的凋亡数目百分率为(12.9±1.51)%、(13.8±2.57)%、(5.03±0.74)%,BMMSCep组细胞凋亡数目显著降低(P 0.05),说明PIM-1能够抑制BMMSCs凋亡。 (4)PIM-1对BMMSCs衰老的影响:应用慢病毒介导的PIM-1转染P9BMMSCs后,P9BMMSCs组、P9BMMSCep组和P9BMMSCe组TERT基因的表达量分别为(1.02±0.082)bp、(2.273±0.153)bp和(1.08±0.183)bp,BMMSCep组中TERT基因的表达量显著高于BMMSCs组和BMMSCe组(P 0.05),说明在P9BMMSCs中过表达PIM-1能够显著提高TERT基因的表达水平。在第6d时,P5BMMSCs组、P7BMMSCs组、P9BMMSCs组、P9BMMSCe组和P9BMMSCep组的吸光度值分别为0.560±0.179、0.527±0.164、0.450±0.120、0.460±0.198和0.534±0.137,P9BMMSCep组的细胞增殖能力显著高于P9BMMSCs组和P9BMMSCe组(P 0.05),而P9BMMSCep组与P7BMMSCs组的细胞增殖能力无统计学差异(P0.05)。细胞周期检测结果显示PIM-1能够促进P9BMMSCs由G0/G1期进入S期,显著提高了细胞的增殖能力,并延缓了P9BMMSCs衰老进程。 结论 (1)采用密度梯度离心联合差速贴壁的方法可以获得高纯度的BMMSCs,随着体外传代次数的增多,细胞增殖能力逐渐降低,传至第9代后BMMSCs逐渐进入衰老状态。 (2)应用慢病毒介导的PIM-1转染P4BMMSCs后,P4BMMSCs增殖能力提高,凋亡数目减少。 (3)应用慢病毒介导的PIM-1转染P9BMMSCs后,能够促使P9BMMSCs由G0/G1期进入S期,提高P9BMMSCep中TERT基因的表达水平,阻滞了BMMSCs的衰老进程。


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