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Tricellulin在铅暴露诱导血—脑脊液屏障通透性改变中的作用及机制研究

苏鹏  
【摘要】:铅作为一种生活中广泛应用但具有毒性的重金属,能够造成人体多个系统和器官功能紊乱和损伤,尤其对中枢神经系统(central nervous system, CNS)的损伤最为严重。儿童由于其发育、代谢的特点,对铅的神经毒性尤为敏感,能够严重影响儿童CNS发育,造成智力下降,认知功能异常等。铅神经毒性的作用机制包括多个方面,近年来研究提示血脑屏障通透性改变在铅神经毒性中的作用越来越引起人们的重视。 血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)、血-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluidbarrier,BCB)在维持大脑内环境稳态中发挥重要作用。BCB是血脑屏障的重要组成部分,位于脑室脉络丛的血液和脑脊液之间,主要由脉络丛上皮细胞组成,能控制脑脊液的形成和运输,并限制血液中有害物质进入大脑。脉络丛上皮细胞之间形成的紧密连接是BCB的重要结构基础,能有效的阻止有害物质从细胞间隙中穿过。紧密连接主要由多种紧密连接蛋白组成,包括occludin家族,claudin家族和JAM家族。近年来,三细胞间紧密连接引起人们的广泛重视。Tricellulin是近年来发现的一个新的紧密连接蛋白,由于主要分布在三细胞间,简称TRIC。TRIC存在于三个上皮细胞的交界处,不仅是紧密连接的重要组成部分,而且在功能上与跨膜蛋白occludin能形成互补作用。TRIC的分布广泛,但是其在脉络丛细胞中的表达及功能尚未见报道。 BCB是铅的重要作用靶点之一,铅暴露能够引起增加BCB的通透性,从而导致脑内铅含量增加。铅暴露改变BCB通透性的具体机制尚不完全明确,可能与铅暴露引起脉络丛上皮细胞间紧密连接蛋白claudin-1的表达下降有关,而TRIC是否在铅诱导的BCB通透性改变中发挥作用尚不清楚。 【目的】 观察TRIC在脉络丛上皮细胞中的表达,探究TRIC在BCB中的作用;建立铅诱导BCB通透性改变的细胞模型,观察铅对TRIC表达水平的影响,并探讨TRIC在铅诱导的BCB通透性改变中的作用及调控机制,从microRNA(miRNA)的角度揭示铅暴露对TRIC表达的影响,为进一步阐明TRIC在BCB中的功能及其在铅诱导BCB通透性改变机制中提供理论依据。【方法】 1.采用免疫荧光染色、Western blot和PCR的方法检测不同发育期SD仔鼠的脉络丛细胞和体外培养不同时间的Z310细胞中TRIC的表达及定位情况。 2.利用Z310细胞建立体外BCB模型,进行siRNA转染后,通过检测跨膜内皮电阻(Transendothelial electrical resistance, TEER)和荧光葡聚糖(FITC-dextran)通透性检测降低TRIC表达对屏障通透性的影响。 3.利用Z310细胞建立铅暴露诱导体外BCB通透性改变模型,采用免疫荧光染色、Western blot、屏障通透性实验及转染高表达质粒等方法检测TRIC在铅诱导体外BCB通透性改变中的作用。 4.通过生物信息学分析预测调控TRIC的microRNA。采用qRT-PCR等方法检测铅暴露后脉络丛上皮细胞内TRIC相关microRNA的表达情况,并采用Westernblot、通透性实验检测相关microRNA对TRIC的表达调控及对BCB通透性的影响。 【结果】 1. TRIC在体内、体外脉络丛上皮细胞中均有表达,并参与BCB的形成 免疫荧光染色结果发现TRIC在脉络丛上皮细胞存在表达,主要在三细胞连接处分布,并且与occludin有共定位现象。RT-PCR和Western blot结果显示,TRIC在脉络丛上皮细胞和永生化大鼠脉络丛细胞Z310中均有表达,并且随着仔鼠的发育和培养时间的延长,TRIC mRNA和蛋白表达呈逐渐升高趋势。TEER和荧光葡聚糖通透性结果发现,降低TRIC的表达可引起TEER下降至对照组的84%(P0.05),葡聚糖通透性增加至对照组的1.5倍(P0.05),提示TRIC在BCB通透性中发挥重要作用。 2.铅暴露能降低TRIC的表达和分布 通过加入5μM和10μM的醋酸铅,利用Z310细胞建立铅暴露诱导体外BCB通透性改变模型,Western blot实验发现铅暴露72h后能显著降低TRIC的蛋白表达(P0.05);免疫荧光染色结果发现铅暴露后TRIC在细胞间的分布明显减少(P0.05)。 3.高表达TRIC能抑制铅暴露引起的体外BCB的损伤 TEER和FITC-dextran通透性实验结果发现,铅暴露能引起体外BCB的通透性增加;转染高表达TRIC质粒后可增加TRIC的蛋白表达水平,并且TRIC在三细胞间的分布也明显增加;高表达TRIC能部分降低铅暴露诱导的体外BCB通透性改变程度(P0.05)。 4. miR-203可能通过调控TRIC蛋白,参与铅诱导的BCB通透性改变 生物信息学预测显示,miR-203可能是调控TRIC的microRNA;qRT-PCR结果显示,铅暴露能引起脉络丛上皮细胞和Z310细胞中miR-203表达升高;加入miR-203inhibitor能有效抑制miR-203的表达(P0.05),并且降低miR-203的表达能部分抑制铅诱导的TRIC蛋白表达下降(P0.05),在一定程度上减轻铅对体外BCB的损伤作用。 【结论】 1.体内、体外实验均证实TRIC在脉络丛上皮细胞间存在表达,且其蛋白含量随发育不断增加,提示TRIC参与BCB的紧密连接的形成;降低TRIC能影响BCB功能的正常发挥。 2.铅暴露能引起Z310细胞中TRIC蛋白表达下降并引起TRIC在细胞间分布减少;高表达TRIC后能够在一定程度上降低铅暴露引起的BCB通透性增加,提示TRIC可能在铅诱导的BCB通透性增加中发挥重要作用。 3.生物信息学分析发现miR-203可能是调控TRIC的microRNA;铅暴露能改变脉络丛上皮细胞中的miR-203的表达,而抑制miR-203的表达能有效减少铅对TRIC蛋白表达的影响,并且在一定程度上抑制铅暴露造成的BCB通透性改变。 综上所述,我们的研究结果证实了TRIC在脉络丛上皮细胞的表达和分布,并发现其在铅暴露诱导BCB屏障损伤中的作用。本研究将为TRIC在BCB中的功能及其在铅神经毒性机制中作用提供理论依据,并为铅诱导BCB通透性损伤的机制提供新的思路。


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