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sFlt-1的表达及其信号通路与早发型子痫前期相关性研究

姚念玲  
【摘要】:目的子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种严重影响母儿健康的产科重症,是以高血压、蛋白尿、水肿、多器官功能障碍为特征的一组疾病,发病率约为5%,病死率约为10%[1],是围产期孕产妇及胎婴儿死亡的重要原因。医学界将妊娠34周前发病的子痫前期称为早发型子痫前期(Early onset Preeclampsia,EPE),发病晚于34周者称为晚发型子痫前期(Late onset preeclampsia,LPE)[7]。早发型比晚发型的发病早,病情重,对母儿的影响更大,各种并发症更多,孕产妇预后及新生儿结局更差。因此明确早发型子痫前期的发病原因、机制、病理过程,病情的发展规律,找到有效的预防、治疗方法就显得尤为重要,并已成为目前医学领域的热点课题。对于早发型子痫前期的治疗,目前仍多以对症治疗为主[65]。发现有效的分子靶点治疗是早发型子痫前期目前亟待解决的临床问题。胎盘生长因子(PLGF)是血管内皮生长因子(VEGF)家族成员之一,其与血管内皮生长因子受体1(Flt-1)结合,发挥促血管生成、促绒毛滋养细胞生长、增殖、浸润的作用,而这种生物学过程可被可溶性血管内皮生长因子受体1(s Flt-1)所阻断[26]。s Flt-1与Flt-1竞争结合VEGF,其中包括PLGF,在完全阻断VEGF的作用同时也阻断了PLGF的促血管生成活性,引起血管生成障碍,影响血管壁的完整性和通透性。s Flt-1对PLGF具有强有力的拮抗作用,对PLGF有调节作功能。有文献报道s Flt-1在高血压、糖尿病、多种肿瘤中的表达是升高的[27]。有学者提出将s Flt-1作为子痫前期的标志物来预测病情。文献提示PI3K/AKT通路参与细胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种生物调节功能。研究表明该通路与人类血管性、代谢性疾病以及肿瘤的发生发展、治疗及预后密切相关[30]。这些研究均提示s Flt-1与PI3K/AKT通路的关联可能成为早发型子痫前期的分子治疗靶点。诸多研究表明细胞组织缺氧与子痫前期的发病相关,许多实验就是利用缺氧模型进行该病的机制研究。基于此,本课题着重探讨了早发型子痫前期患者血清、胎盘、脐带血中s Flt-1和PLGF的表达情况,脐静脉内皮细胞中s Flt-1的表达情况以及缺氧培养的脐静脉内皮细胞中s Flt-1与PI3K/AKT通路的相关性。方法⑴收集西京医院2012年9月至2014年8月收容的早发型重度子痫前期39例(ESPE组);早发型轻度子痫前期45例(EMPE组);同时期、同孕周正常妊娠病例42例(NP组),分别采集患者静脉血、分娩时的脐带血和胎盘。分别用ELISA法和时间分辨荧光免疫法检测三组患者血清和脐带血中s Flt-1和PLGF含量;用实时定量PCR检测胎盘中s Flt-1和PLGF的m RNA的表达;用Western-blot法检测胎盘中s Flt-1和PLGF的蛋白表达。⑵采集正常妊娠人脐带标本,用胰酶消化法制备培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelialcells,HUVECS)。利用免疫荧光法检测CK18,进行了细胞鉴定。⑶建立HUVECS细胞缺氧模型,用Western-blot法检测HIF-1α和TUNEL染色法检测细胞凋亡,鉴定了细胞缺氧的成功诱导。进行缺氧细胞MTT检测,为后续缺氧实验确定缺氧作用时间。⑷分别用实时定量PCR和Western-blot法分别检测s Flt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在正常培养的人脐静脉内皮细胞、缺氧培养24小时及LY294002作用1小时后再缺氧培养24小时条件下的表达。⑸用细胞流氏术测定了不同缺氧方式培养下的脐静脉内皮细胞的细胞周期及细胞凋亡。结果⑴早发型重度子痫前期患者血清中s Flt-1的含量均数为534.5±22.6ng/L,PLGF的含量均数为34.9±8.7ng/L;早发型轻度子痫前期患者血清中s Flt-1的含量均数为398.0±47.7 ng/L,PLGF的含量均数为51.6±10.4ng/L;同时期、同孕周正常妊娠患者血清中s Flt-1的含量均数为212.0±31.9 ng/L,PLGF的含量均数为83.3±9.3ng/L。采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,P0.05,三组均数差异有统计学意义。早发型重度子痫前期脐血血清中s Flt-1的含量均数为331.2±40.4ng/L,PLGF的含量均数为29.0±6.3ng/L;早发型轻度子痫前期脐血血清中s Flt-1的含量均数为192.0±27.7ng/L,PLGF的含量均数为41.3±5.0ng/L;同时期、同孕周正常妊娠脐血血清中s Flt-1的含量均数为98.6±13.9 ng/L,PLGF的含量均数为68.8±8.1ng/L。采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,P0.05,三组均数差异有统计学意义。三组的胎盘中s Flt-1、PLGF在m RNA水平和蛋白水平均有差异,P0.05。⑵成功体外原代培养传代的脐静脉内皮细胞,经鉴定培养的细胞特异性表达CK18,证实构建的细胞模型可靠,可用于后续实验。⑶m RNA和蛋白水平上s Flt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)均在正常培养的HUVECS低表达;在缺氧培养24小时HUVECS高表达;在LY294002作用1小时后再缺氧培养24小时的HUVECS中发现,阻断PI3K/AKT通路的同时s Flt-1的表达也发生了下调,P0.05,差异具有统计学意义。流氏细胞术也证实缺氧使脐静脉内皮细胞发生了G0和G1期阻滞,G0和G1期细胞比例升高,S期比例降低,细胞凋亡增加,而LY294002的导入可减弱缺氧对细胞的这种抑制作用。结论s Flt-1在早发型子痫前期患者血清、脐血和胎盘中较正常妊娠对照高表达,并随着病情的加重而表达升高;PLGF在早发型子痫前期患者血清、脐血和胎盘中较正常妊娠对照低表达,并随着病情的加重而表达降低。说明其可能参与早发型子痫前期的发生发展,有可能作为该病的血清及组织学检测指标。s Flt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在HUVECs缺氧模型中均出现了高表达,说明细胞组织缺氧可能与早发型子痫前期存在某种内在联系,可能参与了早发型子痫前期的发病过程。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用HUVECs1小时后再缺氧培养24小时条件下三因子的表达均下调,说明PI3K/AKT通路可能参与早发型子痫前期的病理过程,可能成为有效的分子治疗靶点。


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