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太白楤木皂苷及其活性单体对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制研究

闫佳佳  
【摘要】:【背景】近年来,无论在发达国家或在发展中国家,缺血性心脏病均是重要的致死性疾病之一,流行性广,严重威胁人类健康。临床上随着溶栓疗法、支架植入等治疗技术的推广应用,心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)成为当今广为关注的热门话题。它可不可逆性损伤心肌细胞,导致左室功能失调及心脏衰竭,最终出现急性心肌死亡。大量研究表明,线粒体功能紊乱是MI/RI发生的主要原因,因此,开发安全有效的MI/R损伤防治药物迫在眉睫。太白楤木(Aralia taibaiensis)广泛分布于我国中西部秦巴山区等地,其根皮提取物主要化学成分为三萜皂苷。早期研究显示,太白楤木皂苷(total saponins extracted from Aralia taibaiensis,s AT)具有抗炎、抗肿瘤、降血脂、降血糖等药理作用,对心脑血管系统也有一定影响,并可提高机体耐缺氧的能力等。故本研究旨在探讨s AT及其活性单体对MI/RI的保护作用及其机制,为寻找安全有效的MI/R损伤防治药物提供理论依据。【目的】1.确定s AT对MI/RI的保护作用及其机制。2.针对s AT分离得到的12个单体进行心肌保护作用的筛选,明确s AT的主要药效物质。3.阐明该主要药效物质发挥心肌保护作用的机制。【方法】1.可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min再灌注3 h复制MI/RI模型,将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、s AT低、中、高剂量组,每组10只。通过试剂盒检测血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平;采用依文思蓝-氯化三苯基四氮唑蓝(evans blue-2,3,5-tetrazolium chloride,EB-TTC)双染法测定心肌梗死面积,苏木精-伊红染色法观察心肌病理学形态变化,TUNEL染色法明确心肌组织凋亡情况。2.采用H9c2心肌细胞模拟缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation,A/R)2 h/4 h损伤模型,参考s AT的药效,比较由s AT分离得到的12个三萜皂苷单体对细胞活力、LDH、CK-MB、细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)表达及caspase-3活性的影响,初步确定s AT中主要药效物质。3.首先,采用结扎冠状动脉复制C57小鼠MI/RI(30 min/3 h)模型,观察CHS低、中、高剂量对小鼠心功能、血清中LDH和CK-MB水平、心梗面积、心脏组织病理性损伤及线粒体形态的影响;其次,建立A/R(2 h/4 h)H9c2心肌细胞损伤模型,检测CHS对H9c2细胞存活率及细胞培养上清液中LDH水平,并观察细胞线粒体膜电位及活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,进一步通过裂解细胞提取蛋白,检测相关蛋白尤其是单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及SIRT3蛋白的含量变化;最后,采用结扎冠状动脉复制SIRT3-/-小鼠MI/RI(30 min/3 h)模型,比较CHS对C57小鼠和SIRT3-/-小鼠心梗面积及心肌组织凋亡的影响,并检测AMPK及SIRT3蛋白含量的变化。【结果】1.揭示s AT能够显著抑制心肌损伤酶LDH、CK-MB释放;升高SOD、CAT及GSH-Px的活性,同时减少MDA的含量;明显降低大鼠心肌梗死面积,逆转心肌组织的病理学改变,并有效抑制心肌组织细胞凋亡。2.相比其他11个皂苷单体,TA35即CHS可显著增强H9c2心肌细胞存活率,降低细胞上清中CK-MB、LDH的释放,逆转caspase-3活性增强并降低Cyt c蛋白表达,进而抑制H9c2心肌细胞凋亡。研究发现TA35的心肌保护作用与s AT相当。故初步确定CHS是s AT的主要药效物质。3.CHS可显著改善小鼠心功能,降低LDH及CK-MB水平,缩小心梗面积,减缓心肌病理性损伤,同时维持心肌线粒体形态。进一步,CHS在增加H9c2心肌细胞活力降低细胞上清中LDH释放的同时,可逆转线粒体膜电位的下降并降低线粒体内ROS生成。具体保护作用可能为:CHS激活AMPK,增加氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)水平,进而上调SIRT3蛋白,且SIRT3又可脱乙酰化肝激酶B1活化AMPK,进一步加强效应。最后,SIRT3基因敲除后,与正常C57小鼠相比,其心肌梗死及组织凋亡均较为严重。【结论】1.证实了s AT能够改善MI/RI,该预防作用很大程度上基于其显著的抗氧化、抗凋亡作用。2.明确TA35即CHS是s AT的主要药效物质。3.CHS是通过调控AMPK-SIRT3信号通路发挥MI/RI保护作用的。


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