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应用Label-free技术研究人牙囊细胞和牙周膜成纤维细胞蛋白质组

弓青霞  
【摘要】:牙囊细胞(Human dental follicle cells,h DFCs)是形成以牙周膜为主体的牙周组织的前体细胞,牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament fibroblasts,h PDLFs)是h DFCs的重要子代细胞,参与牙周膜内胶原纤维等细胞外基质代谢。由于牙周炎较高的发病率及其造成的牙齿缺失,以建立牙周附着为中心的牙周组织再生一直被众多学者关注。而牙周组织中,h DFCs和h PDLFs是具有组织同源性和生物延续性、处于分化不同阶段的细胞。h PDLFs继承了h DFCs的很多特性,如形态上二者都具有成纤维细胞样形态,生物学上都具有的异质性,功能上都具有纤维形成和改建能力。近年对h DFCs向h PDLFs转化的研究也集中在细胞分化及再生有附着性的牙周膜上,这些研究多关注个别基因、蛋白质、细胞因子、信号通路对h DFCs体内、体外成骨、成纤维能力的影响,也有使用高通量方法研究分化前后两种细胞基因水平的差异,但是对h DFCs转化为h PDLFs后的总体细胞代谢、蛋白表达变化并不关注。而在后基因时代,蛋白质表达谱更能体现牙囊和牙周膜功能状态的异同性。从蛋白水平探究细胞在分化前后的差别,有助于发现细胞分化前后哪些蛋白质发生了显著改变,为研究h DFCs成纤维分化机制提供蛋白质水平参考。本研究拟使用Label free蛋白定量技术研究h DFCs和h PDLFs蛋白表达谱及差异表达蛋白质,为寻找h DFCs向h PDLFs转化的重要蛋白质及临床探索再生纤维性牙周附着技术提供参考。目的:1.分离培养h DFCs和h PDLFs及蛋白质样品准备2.获得h DFCs和h PDLFs细胞全蛋白表达谱,进行相似性分析3.寻找h DFCs和h PDLFs差异蛋白质分析,差异蛋白质q PCR验证及细胞代谢差异分析材料和方法:1.分离培养、鉴定h DFCs和h PDLFs,应用SDS-PAGE电泳对h DFCs和h PDLFs细胞总蛋白质进行蛋白丰度初步分析。2.利用LTQ orbitrap Velos液质联用仪配备戴安ultramate 3000 nano-UPLC操作系统对预处理蛋白样品h DFCs1、h DFCs2、h PDLFs1、h PDLFs2中肽段行质谱分析,结合定性定量软件maxquant(1.5.0.12),参考IPI人蛋白质数据V3.87获得h DFCs和h PDLFs的蛋白质原始数据。相同样本进行生物学重复性、关联性分析。对h DFCs和h PDLFs总蛋白质行蛋白比例、蛋白相对含量及基因本体(Gene ontology,GO)分析。3.结合蛋白质鉴定原始数据,对h DFCs和h PDLFs蛋白谱行差异表达分析,并所得差异蛋白质行GO分析、KEGG分析及q PCR验证。结果:1.免疫荧光显示h DFCs和h PDLFs细胞角蛋白阴性表达,波形丝蛋白阳性表达,具有成纤维细胞的生物学特性。SDS-PAGE证明h DFCs和h PDLFs细胞总蛋白质中均无极高丰度蛋白质。2.液相色谱质谱分析h DFCs1、h DFCs2、h PDLFs1、h PDLFs2四样本共获得906个蛋白质组,相同样本间具有较高的重复性和关联性。蛋白比列分析、蛋白相对含量分析及GO分析均显示h DFCs和h PDLFs蛋白质表达谱具有较高的相似性。3.h DFCs和h PDLFs差异表达蛋白质有22个(P0.5,FC2),其中上调蛋白质7个(DRAP1、ECI1、EIF3G、HSP90B1、NIT1、PPP1CB、STX7),下调蛋白质15个(AKR1A1、ALCAM、CDC42、CTGF、CYR61、DDX1、DDX17;DDX5、DDX39A、F2、FKBP4、FST、GDI1;GDI2、MAT2A、RPL18A、TOMM6)。对特定差异蛋白行q PCR验证,显示h DFCs和h PDLFs中FST、CTGF、STX7、NIT1的表达变化与质谱结果一致,但CTGF的组间差别无统计学意义。此外,GO分析显示h DFCs向成纤维细胞分化后伴随着细胞蛋白质合成、分泌功能加强。结论:h DFCs和h PDLFs细胞形态学的相似性、生物学功能上的延续性集中表现在蛋白质表达谱的相似性上。但是由于两种细胞处于牙周组织分化不同阶段及分化前后细胞微环境的差异性持续存在,定量分析证实22个蛋白质有明显的表达差异。本实验获得的差异蛋白质可能是h DFCs较h PDLFs具有更高增殖分化能力、h PDLFs较h DFCs具有更高胶原代谢能力的分子表现。这些差异蛋白质为进一步研究h DFCs向h PDLFs转化及牙周形成机制等提供了线索。


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