收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

非天然氨基酸插入法构建小鼠突变RANKL蛋白的克隆、原核表达及抗血清制备

李锋  
【摘要】:骨质疏松症是主要表现为骨量减少、骨微结构破坏,导致骨骼强度和负荷承受能力降低,易于发生脆性骨折的一类全身性骨代谢障碍疾病,也是多种骨破坏性疾病共有的病理损害。骨质疏松发病率高,严重影响患者的生活质量,给社会带来沉重的经济负担。正常骨代谢主要依赖于破骨细胞发挥的骨吸收作用和成骨细胞发挥的成骨作用之间的平衡。任何原因导致这种平衡的破坏都会引起骨代谢性相关疾病。其中,破骨细胞活性和功能的增强在这一过程中发挥着极其重要的作用。核因子κB受体活化因子配体(RANKL,Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand)对破骨细胞的分化、成熟及功能都发挥着关键性作用。RANKL结合到破骨前体细胞的核因子κB活化因子受体(RANK)上,启动下游NF-κB,P38,ERK,JNK等信号通路,刺激破骨细胞的分化、成熟及功能。阻断RANKL与RANK的结合,可抑制破骨细胞的分化和成熟。抗RANKL单克隆抗体Denosumab可以特异性地阻断RANKL与其受体的结合,有效地的抑制破骨细胞的分化、成熟和功能,对骨质疏松等骨吸收性疾病疗效明显。最近研究表明,在自体蛋白中插入非天然氨基酸可以突破免疫耐受,使机体产生针对自体蛋白高滴度的抗体。本研究探讨非天然氨基酸突变的小鼠RANKL蛋白(p NO2Phe234m RANKL)的克隆、原核表达和纯化,以及用其作为抗原免疫小鼠,制备小鼠抗m RANKL的抗血清,并分析该抗血清的抗体滴度和活性,为进一步探究阻断RANKL-RANK通路的新方法奠定基础。【方法和结果】①首先通过RT-PCR克隆了具有活性的小鼠RANKL(m RANKL)的胞外段基因,将编码第234位酪氨酸的密码子(TGA)突变成能编码p-硝基苯丙氨酸的密码子,然后构建了p ET28a-p NO2Phe234m RANKL重组表达载体并经测序验证构建成功。②成功将p ET28a-p NO2Phe234m RANKL重组表达载体与p EVOL质粒共转化至E.coli BL21(DE3)原核表达菌中,用阿拉伯糖和IPTG诱导,成功表达并纯化了目的蛋白。经SDS-PAGE与Western Blot检测,该蛋白与预测蛋白大小一致;通过高效液相色谱联合质谱检测进一步证实成功插入了p-硝基苯丙氨酸。③以纯化蛋白作为免疫原,采用多位点皮下重复注射的方法免疫小鼠,采用Western Blot和间接ELISA分别检测抗血清活性和抗m RANKL抗体滴度。结果表明,成功制备了小鼠抗m RANKL的抗血清,该抗血清具有较高的活性,既能与p NO2Phe234m RANKL重组蛋白结合,又能与野生型m RANKL结合,效价为1:6400。【结论】通过本实验,我们首次克隆并表达了p-硝基苯丙氨酸突变的小鼠RANKL(m RANKL)的胞外段,通过高效液相色谱联合质谱检测验证了p-硝基苯丙氨酸的成功插入;并以此蛋白为抗原免疫小鼠,制备了小鼠抗m RANKL的抗血清,该抗血清效价为1:6400,具有较高的活性,既能与p NO2Phe234m RANKL重组蛋白结合,又能与野生型m RANKL结合,为后期深入探究阻断RANKL-RANK通路的新方法,进而实现骨质疏松的治疗打下了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 陶惠人 ,王全平 ,张莹莹 ,刘继中 ,李靖;Cloning and expression of ODF /OPGL /RANKL gene related to osseous absorption disease[J];中国临床康复;2002年20期
2 赵为公,韩学哲,李新友,郭雄,刘淼;CPG OLIGONUCLEOTIDES REGULATE OSTEOCLAST DIFFERENTIATION[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2005年01期
3 张晶,向晓明,李成章;RANKL/RANK/OPG调节系统在牙周炎发病机制中的作用[J];口腔医学研究;2005年04期
4 叶超群;纪树荣;钟兴明;;RANKL-RANK-OPG骨调节轴[J];首都体育学院学报;2006年06期
5 高坤;裴福兴;;RANKL/RANK/OPG系统的临床意义[J];华西医学;2007年04期
6 罗成燕;王凌;李大金;;RANKL-RANK-OPG环路在骨免疫网络中的调节作用[J];中国免疫学杂志;2008年04期
7 张志梅;李玉坤;;RANKL与骨代谢[J];中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志;2010年01期
8 ;Effects of Anastrozole Combined with Shuganjiangu Decoction on Osteoblast-like Cell Proliferation, Differentiation and OPG/RANKL mRNA Expression[J];Chinese Journal of Cancer Research;2012年02期
9 赵剑;;RANKL/RANK/OPG系统生物学功能的研究进展[J];现代诊断与治疗;2013年01期
10 陶可;曾晖;肖德明;熊奡;翁鉴;康斌;;Influences of IL-6R Antibody on PMMA Bone Cement-mediated Expression of OPG and RANKL in Synovial Fibroblasts[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年02期
11 曾润铭,金大地,邹育才,林菁,张忠民,刘梦璋,赵资坚;甲氨蝶呤对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞表达RANKL的影响[J];中华风湿病学杂志;2005年09期
12 高飞,霍建忠;不同龄小鼠成骨细胞OPG和RANKL表达的变化[J];中华风湿病学杂志;2005年04期
13 李龙;周忠启;曾家顺;;RANKL在佐剂性关节炎大鼠滑膜中的表达及亚砷酸对其影响[J];中国骨伤;2007年05期
14 刘臻;邱勇;孙强;吴洁;陈军浩;陈蕾蕾;马薇薇;;RANKL/OPG在青少年特发性脊柱侧凸患者低骨量发生机制中的作用[J];中国骨质疏松杂志;2007年07期
15 毛强;俞楠泽;江彬锋;金红婷;;RANKL/RANK/OPG系统及其在激素性骨坏死中的作用[J];内蒙古中医药;2009年22期
16 廉永云;裴福兴;程惊秋;俞明哲;;塞来昔布对钛颗粒刺激的外周血单核细胞中RANKL基因表达的影响[J];中国矫形外科杂志;2010年18期
17 郑东辉;戴冽;韦秀宁;朱浪静;莫颖倩;张白玉;邹婵娟;;类风湿关节炎滑膜成纤维细胞通过高表达RANKL促进破骨细胞分化及活化[J];中华关节外科杂志(电子版);2011年05期
18 王玉东;陶敏芳;王丽华;黄勇;万小平;;β雌激素受体介导脱氢表雄酮对OPG/RANKL的升调节[J];中国药理学通报;2012年04期
19 陈秋月;商澎;;RANKL与骨重建[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年05期
20 王怡;刘伟;赵鸿雁;代楠楠;顾建红;刘宗平;;镉对大鼠成骨细胞OPG/RANKL表达的影响[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2014年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 韦秀宁;;类风湿关节炎滑膜成纤维细胞通过RANKL促进破骨细胞分化和活化[A];中华医学会第六次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会成立十周年论文汇编[C];2011年
2 何成;楼觉人;;毕赤酵母表达RANKL-HBsAg作为治疗性骨质疏松症疫苗的研究[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
3 ;Up-regulated expression of RANKL on T cells in proinflammatory microenvironment of rheumatoid arthritis[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
4 何成;楼觉人;;毕赤酵母表达RANKL-HBsAg作为治疗性骨质疏松症疫苗的研究[A];2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集[C];2011年
5 韦秀宁;戴冽;朱浪静;莫颖倩;郑东辉;;过氧化物酶体增殖活化受体γ激活抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞表达炎症因子及RANKL[A];第17次全国风湿病学学术会议论文集[C];2012年
6 林昌松;陈秀敏;林云斌;刘清平;徐强;关彤;陈纪藩;刘风震;吴莹;;昆母汤对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖及RANKL/骨保护素系统的影响[A];全国第十一届中西医结合风湿病学术会议论文汇编[C];2013年
7 沈霖;;绝经后骨质疏松症患者β-catenin与RANKL/OPG的相关性研究[A];中华医学会第七次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议论文汇编[C];2013年
8 韦秀宁;戴冽;朱浪静;莫颖倩;郑东辉;欧阳霞;邹婵娟;;类风湿关节炎滑膜成纤维细胞通过RANKL促进破骨细胞分化及活化[A];中华医学会第三次骨质疏松和骨矿盐疾病中青年学术会议论文汇编[C];2011年
9 李霞;孙凌云;;白细胞介素-23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RANKL表达作用中的研究[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年
10 刘幼硕;罗湘杭;袁凌青;谢辉;廖二元;;脂联素对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响及细胞信号转导机制研究[A];中华医学会第八次全国老年医学学术会议论文汇编[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐胜前;OPG和RANKL基因多态性、蛋白水平的表达在类风湿关节炎患者疾病活动性骨与关节损伤中的意义[D];安徽医科大学;2014年
2 周谊霞;DKD大鼠肾组织中GSK-3β对GSK-Wnt通路与RANKL-NF-κB通路交互作用相关因子调控机制研究[D];贵阳医学院;2015年
3 吕大伟;抗RANKL单克隆抗体在大鼠类风湿性关节炎模型中的应用及RANKL转录调控的探索性研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
4 黄云梅;基于RANKL/RANK/OPG轴的绝经后骨质疏松症发病机制及健骨颗粒干预研究[D];福建中医药大学;2014年
5 唐振宁;RANKL/RANK途径对人乳腺癌细胞迁移作用及其调节机制的研究[D];第三军医大学;2011年
6 赵宗茂;RANKL对成人骨髓间质干细胞向神经细胞分化的影响研究[D];河北医科大学;2003年
7 王清平;雌激素对脂联素调控人成骨细胞分化及OPG/RANKL表达的影响[D];中南大学;2010年
8 汪龙;RANKL/RANK/OPG系统在感染松动假体周围骨溶解中的作用[D];中南大学;2014年
9 赵伟;RANKL/OPG在强直性脊柱炎外周关节骨质破坏病理机制中的作用[D];中国人民解放军军医进修学院;2003年
10 姜莉;破骨细胞和OPG/RANK/RANKL系统在银屑病关节炎骨质破坏中的作用机制[D];复旦大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 林育菲;OPG和RANKL的表达在鼓室硬化症的作用[D];福建医科大学;2015年
2 赵勤;电针命门穴对去卵巢骨质疏松大鼠OPG/RANKL系统的影响研究[D];福建中医药大学;2015年
3 张翠娟;辅酶Q10对糖尿病大鼠牙周炎牙龈组织MMP-9和血清OPG、RANKL的影响[D];河北医科大学;2015年
4 彭丽萍;血清RANKL、OPG联合磁共振扫描在早期类风湿关节炎诊断与骨关节损伤中的研究[D];安徽医科大学;2015年
5 史慧;IL-27、RANKL在类风湿关节炎中的变化及其对骨质疏松的影响[D];山西医科大学;2015年
6 李金潺;1,25(OH)_2D_3对类风湿关节炎成纤维滑膜细胞IL-22介导的RANKL表达的可能机制研究[D];山西医科大学;2015年
7 黄哲敏;类风湿关节炎患者血清IL-34和RANKL水平变化及与骨质疏松的关系[D];山西医科大学;2015年
8 马林霄;RANKL在非绝经期系统性红斑狼疮合并骨质疏松症患者中的临床研究[D];苏州大学;2015年
9 李锋;非天然氨基酸插入法构建小鼠突变RANKL蛋白的克隆、原核表达及抗血清制备[D];第四军医大学;2015年
10 袁晓军;金属(钴、铬)离子诱导成骨样细胞RANKL/OPG表达及其信号转导分子机制的实验研究[D];南昌大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 记者 杜华斌;科学家发现RANKL蛋白可“召唤”癌细胞转移[N];科技日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978