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糖尿病来源的骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的相关研究

刘宇  
【摘要】:目的:骨髓间充质干细胞(MSC)治疗心肌梗死(MI)是MI治疗可选择的治疗手段之一,MSC可以通过旁分泌机制分泌多种细胞因子,发挥其抑制凋亡、促进血管新生、调节心室重塑、改善心脏功能的作用。与MSC移植治疗MI的动物实验不同,其临床试验的效果并不确切。其原因可能是临床患者常合并其他疾病,如糖尿病等。目前关于糖尿病人的MSC的生物学特性及其基因表达差异尚无报道。本研究的目的是比较糖尿病来源与非糖尿病来源的MSC在基因表达方面存在的差异,及其在治疗心肌梗死方面的差异,发现可能引起这些差异的关键细胞因子(Bcl-2、Bcl-x L),并验证通过MSC修饰Bcl-x L是否可以增加MSC的存活率、改善心脏功能。方法:本实验通过Affymetrix全基因组基因芯片技术进行MSC功能基因表达谱分析,以期发现冠心病合并糖尿病(CAD+DM)患者与冠心病非糖尿病(CAD)患者MSC基因表达的差异。并通过慢病毒转染基因修饰MSC的方式研究h Bcl-x L在增加MSC在心肌梗死区域存活率、促进血管新生、抑制凋亡、改善心脏功能等方面的作用。主要内容包括三部分:1、冠状动脉旁路移植(CABG)术中获取患者骨髓,体外扩增MSC,收集第3代细胞进行流式细胞仪筛选鉴定、绘制生长曲线、提取RNA制作基因芯片、比较基因表达差异。2、CAD+DM与CAD患者MSC移植到大鼠心肌梗死区域,观察其对于心肌梗死的治疗作用(抑制凋亡、改善心脏功能),以及Bcl-2、VEGF等表达情况。3、应用慢病毒载体转染系统转染h Bcl-XL-IRES2-EGFP融合基因达到过表达,同时单独转IRES2-EGFP作为对照。通过荧光显微镜、WB方法验证病毒转染效率;流式细胞技术测定是否增强细胞抗凋亡的能力、ELISA测定MSC在低氧培养基上清中细胞因子变化,确定基因修饰后细胞分泌功能的变化。进而进行治疗心肌梗死的动物实验,观察是否能够提高MSC在梗死区的存活率、抑制梗死区域的细胞凋亡、减少瘢痕形成、促进血管新生、改善心脏功能。结果:1、糖尿病患者来源的MSC具有MSC的生物学特性:表达CD29、CD44;不表达CD34、CD45,体外培养发现其增殖能力显著低于非糖尿病患者来源的MSC;2、Affymetrix基因芯片证实:CAD+DM组与CAD组MSC相比较,功能蛋白表达基因中涉及细胞凋亡、细胞因子、细胞内信号传导系统的基因有27个,其中13个基因表达明显上调,分别为TNFRSF10B、TNFRSF21、NGF、CAV2、ITGA8、TNS1、ITGA2、AKT3、MBP、MAP2、INHBA、FST、PLA2G5;有14个基因表达明显下调EPR1、BIRC5HELLS、BCL2、HGF、CASP1、SEPP1、ITGA9、MAP2K6RUNX3、TGFBR2、RUNX2、CTNNB1、CDC42。3、CAD+DM组与CAD组MSC细胞移植到大鼠心肌梗死边缘区均能显著抑制心肌细胞凋亡、改善心脏收缩功能,但CAD+DM组这些作用与CAD组相比显著降低,可能与CAD+DM组移植后Bcl-2表达显著低于CAD组有关。4、慢病毒可以安全、有效的转染h Bcl-x L-IRES-EGFP融合基因、IRES-EGFP融合基因到MSC内,EGFP的共转染可以确定转染效率并测定后续动物实验中MSC的存活率。研究显示,病毒转染未影响MSC的生物学特性,过表达h Bcl-x L可以增加MSC分泌细胞因子和抗凋亡能力,Western Blot检测、Annexin V/PI检测、ELISA检测显示,h Bcl-x L基因修饰的MSC表达h Bcl-x L显著增加、抗凋亡能力增强、分泌VEGF、IGF-1、PDGF等细胞因子增加(p0.05)。5、h Bcl-x L基因修饰的MSC移植治疗心肌梗死的在体实验提示:过表达h Bcl-x L的MSC在移植区域的存活率提高、可以显著降低梗死边缘区心肌细胞凋亡、促进毛细血管新生、减少瘢痕组织形成、改善心脏功能(p0.05)。结论:1、糖尿病来源的MSC在细胞增殖等方面与非糖尿病来源的MSC存在显著差异,两者存在基因表达差异,其Bcl-2表达显著降低;2、糖尿病来源的MSC治疗大鼠心肌梗死疗效与非糖尿病来源的MSC相比显著降低;3、应用慢病毒转染系统转染使MSC高表达Bcl-x L后可以显著提高MSC在低氧条件下的抗凋亡能力、显著增加VEGF、IGF-1、PDGF等细胞因子的分泌。4、高表达Bcl-x L的MSC移植到心肌梗死区域可以显著提高MSC的存活率、抑制细胞凋亡、促进血管新生、抑制瘢痕形成、改善心脏功能。


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