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Notch重组配体D1R在促进造血重建中的作用与机理

陈娟娟  
【摘要】:当罹难者意外暴露于不同剂量电离辐射时,如何治疗辐射诱发的急慢性骨髓损伤是当今局部战争时代的一个重要课题。外界各种应激性刺激包括氧化应激、贫血、缺氧刺激、电离辐射、毒性化学药物以及炎症刺激等,容易损伤造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC),进而扰乱造血稳态、损害造血重建。其中被广泛应用于治疗血液系统恶性肿瘤或者实体瘤的放疗和高剂量化疗,也会引起骨髓以及造血微环境的损害,导致造血干细胞数量减少、残存HSC功能缺陷,限制HSC的再生能力和分化潜能,阻碍造血恢复。目前临床上主要通过各种造血生长因子如G-CSF、IL-11、TPO以及EPO等刺激造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)增殖和分化以缓解急性骨髓抑制。但是,对于骨髓损伤后造血重建过程的发生发展以及机理机制仍知之甚少。已有研究表明,诸多参与调控造血稳态的信号通路如Notch信号途径、凋亡信号、TGF-β信号通路、细胞因子以及细胞外基质蛋白等,也参与了造血重建的过程,并且受骨髓微环境内脉管系统的部分调节。对科研工作者而言,造血微环境niche的神秘性已持续多年,大量科学研究旨在揭示niche的细胞成分和分子调控机制。近年来随着分子影像和转基因技术的飞速发展,人们发现不同类型的血管龛参与骨髓损伤后造血静息态、细胞增殖以及骨髓重建之间的平衡和调控。目前已明确造血干细胞龛的主要组成细胞包括血管周细胞、骨髓窦状内皮细胞(sinusoid endothelial cells,SECs)、成骨细胞、交感神经、非髓鞘性施旺细胞以及巨噬细胞等。同时,造血微环境中一系列复杂的可溶性调控元件、内源性的信号通路以及受粘附分子、局部氧分压、其他细胞niche相互串话调控的微环境信号通路等,对造血干细胞的维持具有重要意义。参与其中的分子成分主要有血管周细胞相关的SCF/CXCL12信号轴、复杂但作用不明确的Wnt信号通路和Notch信号通路、钙黏蛋白N、TGF-β以及niche中的其他组分等。因此,研究并利用干细胞池内的细胞和环境因素,寻求新策略促进骨髓抑制后造血恢复具有重要意义。已有研究表明,在脊椎动物发育过程中,高度保守的Notch信号通路对维持胚胎发育期HSC的发生必不可少,同时在各系造血细胞发育过程中Notch也发挥着重要调控作用。Notch信号需要相邻细胞间Notch配体与受体直接接触才能被激活。前期研究发现,Notch受体广泛表达于造血干细胞及其子代细胞,Notch配体则高表达于骨髓造血微环境中,这为在骨髓造血龛中特异性激活Notch信号提供可能。在早期造血调控过程中,Notch受体在造血细胞中的表达情况决定着细胞分化命运,特定的造血祖细胞会按Notch预设的路径进行分化,比如Notch1能促进T细胞和巨核细胞的产生,Notch2则决定红系祖细胞的分化。虽然已明确Notch信号能在体外调节HSC的自我更新和分化,但是经典Notch信号途径调控体内造血干细胞维持以及Notch信号是否必不可缺仍存在争议。其原因在于:1、Notch信号自身具有复杂性;2、体内环境错综复杂;3、方法学上缺乏有效的研究和评估手段。因此,寻找新技术促进HSC体内扩增,利用造血微环境中的基质细胞和调控因子维持造血干细胞的―干性‖,避免恶性转化,对于支持临床药物开发最终实现造血快速恢复具有重要意义。本课题拟通过基因修饰小鼠骨髓抑制模型,明确Notch信号途径对骨髓损伤后应激造血的调控作用;研发新型内皮靶向Notch信号激活剂m D1R重组蛋白,在细胞和分子水平确认蛋白活性后,从整体动物水平评估Notch活化配体m D1R在电离辐射以及化学药物所致骨髓抑制模型中的生物学效应;结合生物信息学和分子生物学等手段,对Notch信号通路调控应激造血损伤后骨髓重建的分子机制进行探讨。主要研究结果如下:1、Notch信号缺失不利于造血系统损伤再修复利用骨髓特异性剔除RBP-J遗传修饰小鼠急性电离辐射损伤模型,发现Notch信号通路是骨髓损伤再修复过程中的重要调控通路,证实Notch信号以正调节子身份参与骨髓损伤后造血再生和谱系分化命运的调控。2、新型Notch激活剂m D1R能挽救骨髓抑制,促进造血干细胞以及髓系细胞重建将Notch配体Delta like 1的DSL结构域和整合素分子αVβ3特异性配体RGD九肽相融合,表达出新型内皮细胞靶向的Notch信号激活剂——重组蛋白m D1R。在电离辐射以及化学药物诱导野生小鼠多种骨髓损伤模型中,证实m D1R具有体内激活Notch信号、挽救骨髓损伤、造血动员、促进髓内外造血重建、扩增造血干祖细胞尤其长期造血干细胞、倾向性促进髓系造血快速恢复的生物学效应。3、m D1R挽救骨髓损伤具有剂量相关性利用野生小鼠急性电离辐射骨髓损伤模型,证实m D1R促造血重建作用具有剂量相关性,摸索出m D1R的最佳剂量范围,发现其具有浓度过低无效、浓度过高抑制的特点,对未来用药具有指导意义。4、m D1R与G-CSF无协同效应对接受急性电离辐射的野生小鼠联合应用m D1R以及经典升白药物G-CSF,发现二者具有相似的髓系扩增能力,但不具有协同升白效应;同时证实m D1R更利于辐照后造血干祖细胞恢复,提示内皮靶向Notch信号激活剂m D1R可能具有更广阔的应用前景。5、m D1R在小鼠体内无毒副作用在前期已证实m D1R对小鼠主要脏器无毒副作用的基础上,着重观察了辐照损伤模型小鼠停药后3个月和6个月造血系统的各项指标,发现短期应用m D1R重组蛋白小鼠髓内外造血重建良好,未见血液系统以及实体器官恶性转变,与正常小鼠基本无差别;在化学药物损伤模型中,血液系统快速重建后的复原时间则更短(仅为14天),确保了m D1R作为一种新型转化医学药物的使用安全性。6、Notch信号上调CSF2RB2表达,激活STAT3生存信号通路利用生物信息学技术筛选以及体内外实验证实,m D1R激活Notch信号途径后能显著上调Csf2rb2转录本表达;报告基因和染色质免疫共沉淀实验从基因调控水平证实,ICN1能识别Csf2rb2启动子序列的RBP-J结合位点,有效激活Csf2rb2基因表达,进而活化Notch下游STAT3/Erk生存信号通路,这与m D1R抑制造血干祖细胞凋亡而不影响细胞增殖的细胞学机制相互映证。7、临床证实Notch信号与造血干细胞移植预后存在正相关性利用免疫荧光染色以及实时定量PCR证实,临床上实施造血干细胞移植患者的骨髓重建速度和造血恢复能力与造血细胞内Notch信号的激活程度呈正相关性,同时也与造血细胞CSF2RB基因表达水平呈现部分相关性,为未来判断预后以及研发新药提供了可靠依据。综上所述,本研究独创性的提出Notch信号以正调节子的身份参与了放化疗诱导骨髓抑制后造血干细胞重建以及髓系重建,为后续研发促进骨髓抑制患者造血重建的新型辅助用药奠定了基础,主要结论如下:1、利用遗传修饰小鼠骨髓抑制模型证实Notch信号途径参与应激造成骨髓抑制后的造血重建。2、课题组自主研发了靶向骨髓血管龛内窦状内皮细胞的新型Notch信号激活剂,多种模型、多个角度全面证实外源性激活Notch信号有利于骨髓抑制后机体造血干细胞尤其长期造血干细胞的维持,实现了短期内骨髓快速重建,降低了机体死亡率,缓解了电离辐射和化学药物诱发的长期遗传毒副作用。3、在体内证实D1R具有促进造血损伤后髓系重建的生物学功能,提出Notch信号在造血稳态时不影响髓系分化,但在应激损伤时能倾向性促进造血干祖细胞向髓系祖细胞分化,进而快速恢复髓内外粒细胞以及单核细胞数目,增强机体抵抗感染的能力,独创性的论证了应激造血条件下Notch信号调控髓系快速恢复的生物学效应。4、体内证实造血损伤早期外源性D1R蛋白通过激活Notch/CSF2RB2/STAT3/Erk信号轴,维持造血干祖细胞存活,抑制细胞凋亡,确保后续骨髓重建的基石。5、在临床骨髓移植患者体内证实Notch信号的激活程度与预后存在正相关性。


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