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Notch信号在小鼠创伤性脑损伤后神经元死亡中的作用及机制研究

王凯  
【摘要】:研究背景创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是指由诸如剪切、撕扯、牵拉等性质的机械力对脑组织所造成的物理性损伤,可导致挫伤、出血和水肿等即刻的临床效应。TBI是一种常见的中枢神经系统损伤性疾病,致残、死率极高。研究发现,引起TBI的主要机制包括谷氨酸兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应等等,而这些病理机制作用的最终结果则导致神经元的死亡及其相关功能的丧失。严重脑损伤患者即使被挽救生命,但因为神经元的死亡是无法再生替代的,因此损伤引起患者的多种功能缺陷仍的后期恢复还缺乏有效的治疗措施,给家庭与社会造成巨大的经济负担和精神负担。目前对TBI后分子代谢及调控的机制还不十分清楚。因此,积极探索内源性调控神经元死亡和存活的关键分子成为TBI治疗的重要策略。Notch信号作为一类在物种进化过程中高度保守的信号通路,在神经系统的发育和分化过程中发挥着重要的作用。累积的研究结果发现在多种不同类型的脑损伤模型中均存在Notch信号的激活。通过化学抑制剂或基因调控的方法抑制Notch信号的活性及表达在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。然而,一些研究也报道抑制Notch信号加重了缺血性脑损伤后的神经细胞损伤。这些矛盾的结论使Notch在神经元损伤中的作用充满争议。因此,探索并了解Notch信号在TBI后发挥何种作用及相关的作用机制对于TBI的救治来说具有重要的理论和现实意义。实验目的(1)探索Notch在TBI后的时空变化规律及功能;(2)探索Notch在TBI后神经元凋亡和自噬中的作用及相关的机制;(3)探索TBI后自噬对凋亡的影响作用。实验方法(1)细胞培养:离体的皮层神经元培养;(2)造模:动物实验采用液压打击致脑损伤模型,离体实验使用机械性划伤模型,分别模拟在体与离体条件下的创伤性脑损伤;(3)神经元致伤效果:采用LDH试剂盒检测细胞损伤破坏的程度,采用CCK8试剂盒检测神经元损伤后的存活数量;(4)分子表达与空间定位:分别采用免疫荧光、Western blot及免疫组化等方法检测主要分子的表达规律及空间定位;(5)脑损伤程度:采用干湿重法检测TBI后小鼠脑水肿的程度;采用神经功能学评分评估TBI后小鼠神经功能受损的程度;(6)细胞凋亡:western blot、Caspase检测试剂盒以及TUNEL染色检测细胞凋亡;(7)Notch调控:利用Notch信号抑制剂GSI及下调Notch信号在神经元的表达,采用Notch激动剂重组鼠jagged1蛋白上调Notch信号的活性;(8)ERK通路调控:使用特异性阻断剂PD98059抑制ERK通路的活性;(9)自噬调控:利用自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂雷帕霉素分别来下调和上调自噬,并通过检测LC3的蛋白表达反应自噬水平。实验结果实验一:与对照组比较,离体神经元机械性划伤模型可在伤后1h显著升高神经元LDH的漏出并减少存活细胞数量;划伤后6h在光镜下可见视野内神经元数量明显减少,Hochest染色显示神经元中的凋亡细胞数明显增加,透射电镜下可看到双层膜的自噬体,免疫荧光结果显示NICD主要定位于胞浆和胞核。在小鼠液压打击脑损伤模型中:与对照组比较TBI后出现明显脑水肿及神经功能障碍;TBI24h后TUNEL染色显示损伤侧皮层中TUNEL染色阳性的神经元数量明显增加,DAB染色显示NICD阳性细胞较对照组显著增加,主要定位在损伤侧皮层部位神经元的胞核中。此外,离体和在体的western blot检测均显示:TBI后神经元中NICD、活化caspase3与LC3Ⅱ的表达均早期开始上调,达到峰值后逐渐回落。实验二:分别在离体和在体模型上给予Notch信号抑制剂GSI预处理,两种模型上NICD的表达均受到明显抑制。GSI显著降低离体神经元机械性划伤6h后LDH漏出并增加了细胞存活。Western blot检测显示GSI明显降低了细胞划伤后的caspase3和LC3的激活。在体模型中与TBI组相比,GSI明显降低了TBI后小鼠脑含水量并改善了其功能学评分,western blot检测同样显示GSI预处理明显降低了活化caspase 3和LC3Ⅱ的蛋白表达量,TUNEL检测显示给予GSI处理降低了TUNEL阳性细胞量。实验三:离体培养的神经元机械性划伤后磷酸化ERK的表达从伤后1h出现高表达,随后逐渐回落至24h恢复正常水平。使用ERK抑制剂PD98059预处理可明显降低磷酸化ERK水平,同时活化caspase 3和LC3Ⅱ的表达也受到明显抑制。PD98059显著降低离体神经元机械性划伤后LDH漏出并增加了细胞存活率。使用GSI抑制Notch信号后,发现磷酸化ERK明显下降。同时给予Notch激动剂jagged1和PD98059后发现jagged1可明显上调损伤后NICD、磷酸化ERK、活化caspase 3和LC3Ⅱ的蛋白表达,而jagged1的这些作用可被PD98059明显抑制.实验四:离体培养的神经元机械性划伤前1h给予自噬抑制剂3-MA和激动剂雷帕霉素预处理。损伤后6h发现3-MA可明显降低LC3Ⅱ表达和神经元存活率并增加细胞LDH漏出,TUNEL染色显示3-MA明显增加了TUNEL阳性细胞数量,同时雷帕霉素则发挥了完全相反的作用。最后使用caspase活性试剂盒检测发现激活自噬可能通过调控线粒体caspase 9活性来影响凋亡。实验结论我们的研究结果证实,TBI后阻断Notch信号可产生神经保护效应;Notch信号可能与ERK相互作用共同调节了TBI后神经元的凋亡和自噬;自噬在TBI后发挥神经保护作用且调控自噬可影响TBI引起的神经元凋亡。该研究结果证明了Notch参与神经元TBI后死亡的调控,为TBI的机制研究和临床治疗提供了新的思路和视角。


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