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不同力学因素作用下人源MG-63成骨样细胞差异基因表达的研究

张连昌  
【摘要】:成骨细胞是骨形成细胞,在新骨形成和旧骨吸收的稳态平衡中具有十分重要的意义。适当应力刺激作用于成骨细胞后可通过多种信号转导通路传导至细胞内部,促使成骨细胞分泌多种生长因子、转录因子,从而影响成骨细胞生物学功能。目前已证实,流体剪切应力是成骨细胞和骨细胞在生理状态下感受到的主要机械应力刺激。此外,重力作为一种场力,也可影响成骨细胞的功能。在航天飞行中的失重环境可导致航天员出现骨质丢失,主要原因就是失重所导致的成骨细胞功能下降,骨形成能力降低。目前,应力和重力刺激对成骨细胞生物学功能影响的研究多集中在某个或者某些已知与成骨细胞功能密切相关的分子物质,但基因水平的变化机制尚不明确。基因芯片技术将探针分子密集固定于支持物表面后与预先标记荧光染料的样品(蛋白质、cDNA等)进行杂交,通过测量探针的荧光强度从而获得样品的表达情况和序列信息。因此,利用基因芯片研究应力和重力等力学因素调控成骨细胞生物学功能的分子类型,对探索失重性骨质丢失的细胞生物学机制,寻找对抗失重性骨质丢失的分子靶点,开发新型对抗措施具有重要意义。本课题针对流体剪切应力和重力两种力学因素作用下成骨细胞基因表达谱的变化开展研究工作。通过基因芯片技术,分别检测了流体剪切应力作用后人源mg-63成骨样细胞基因表达谱的变化,回转器模拟失重后mg-63细胞基因表达谱的变化,并选择在两种应力变化下均显著差异表达的基因esm1,进一步探讨了esm1对成骨细胞生物学功能的影响。具体实验结果如下:一、流体剪切应力作用后mg-63细胞差异基因研究mg-63细胞以适当密度(1×105个/孔)接种于载玻片(25.5×21.5mm),于六孔板中常规培养72h。将细胞随机分为剪切应力组和正常对照组。剪切应力组移至流体剪切系统中给予符合在体生理范围的流体剪切应力刺激(1.5pa,60min)。正常对照组细胞给予除流体剪切应力作用外的相同处理。处理结束后分别提取两组总rna,对rna进行质检,合格后进行affymetrix基因芯片杂交扫描,并对芯片结果进行生物信息学分析。经过芯片扫描,发现剪切应力组与正常对照组相比,有6223个基因发生了改变,其中表达上调基因2554个,表达下调基因3669个。geneontology注释分析发现,差异基因主要参与细胞的转录调控、细胞内信号级联响应、细胞凋亡调控和细胞增殖等功能调控。pathway富集注释分析还发现差异表达基因主要参与了mapk信号通路、tgf-β信号通路、p53信号转导通路、focaladhesion信号转导通路和wnt信号转导通路的信号调控。在上调和下调表达变化倍数最大的各10个差异基因中,15个基因尚未见在成骨细胞中开展过研究报道。二、模拟失重后mg-63细胞差异基因研究mg-63细胞以适当密度(1×105个/孔)接种于载玻片(25.5×21.5mm),于六孔板中常规培养72h。将细胞随机分为模拟失重组和正常对照组。模拟失重组置于2d-rwvs型双向多样本回转器中回转,回转速度24rpm,作用时间48h。正常对照组细胞在回转舱中静置相同时间。处理结束后分别提取两组的总rna,质检合格后进行affymetrix基因芯片杂交扫描,并对芯片结果进行生物信息学分析。基因芯片扫描结果发现,模拟失重组与正常对照组相比,197个基因发生了改变,其中表达上调基因151个,表达下调基因46个。geneontology注释分析发现,表达上调基因主要参与细胞生物合成进程的负性调控和细胞死亡的调控等功能调控。表达下调基因主要参与细胞骨架联接、细胞大分子物质代谢等细胞组分和功能调控。差异表达基因翻译蛋白相互作用分析发现,fos、fosb、stat3和hbegf等差异表达基因的蛋白产物与其他差异表达基因蛋白产物相互作用关系紧密。在上调和下调表达变化倍数最大的各10个差异基因中,13个基因尚未见在成骨细胞中开展过研究报道。三、模拟失重后差异表达基因esm1对成骨细胞生物学功能的影响流体剪切应力和模拟失重后的基因芯片结果中,均显示esm1发生显著性差异性表达。为此,我们对esm1在成骨细胞生物学功能中的作用进行了验证性研究。首先,使用实时荧光定量pcr技术验证回转器模拟失重后mg-63细胞中esm1基因的表达变化;其次,通过转染sirna抑制esm1基因表达,观察mg-63细胞增殖、分化、矿化能力的变化。结果证实,在模拟失重后esm1的基因表达显著上调。通过转染sirna沉默esm1表达后,mg-63细胞增殖能力显著增强,表明esm1对mg-63细胞的增殖有负性调控作用;抑制esm1表达后,mg-63细胞分化标志物alp、runx2表达量显著下降,表明esm1对mg-63细胞的分化有正性调控作用;抑制esm1表达后,茜素红染色表明细胞矿化能力显著增强,表明esm1对mg-63细胞的矿化有负性调控作用。综上所述,流体剪切应力和模拟失重作用后人源mg-63成骨样细胞的基因表达谱发生了显著改变。差异表达基因广泛参与细胞的分子功能、细胞组分、生物学途径和信号通路调控。同时,在高倍数差异表达的基因中,较多基因在成骨细胞功能调控中的作用尚不明确。本研究的成果,为开展力学因素调控成骨细胞功能的细胞学机制研究提供了大量有意义的分子靶点,其中esm1的初步研究结果证实了可以通过生物信息学的方法选择出合适的研究靶点。通过对这些差异基因开展进一步的研究,将对阐明力学因素作用下成骨细胞生物学功能改变的分子机制,寻找对抗失重性骨质丢失的分子靶点,开发新型对抗措施具有重要意义。


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