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1.癌基因PIK3CA和Yap协同促进肝癌的发生 2.敲除FASN抑制AKT诱导的肝癌发生

李小磊  
【摘要】:目的:原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,同时也是世界上肿瘤性死亡的主要原因。肝细胞型肝癌和胆管细胞型肝癌是原发性肝癌的主要类型,分别占肝癌的90%和10%左右。此外,还有一种少见的肝癌,即肝细胞和胆管细胞混合型肝癌。由于持续增加的发病率和不良预后,研究肝癌治疗的新方法有重要意义。为此,我们需要深入研究肝癌发生的分子机制。Yap是Hippo抑癌基因通路下游主要的效应分子之一,它在进化中高度保守,是调控器官大小、再生、干细胞自我更新和肿瘤发展中一个重要分子。近来,大量的研究表明,Yap在多种肿瘤表达上调,包括结肠癌、卵巢癌和肺癌。Yap已经被证实为肝癌发生的驱动致癌基因,并且是预测肝癌生存的独立因子。PI3K/m TOR通路(The phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin)在多种肿瘤中被异常激活,包括在30%-50%的肝癌中。该通路在许多重要的细胞过程中发挥重要的作用,包括生长、增殖、生存、自噬、代谢和细胞骨架重组。PI3K是一个异源二聚体的磷脂酰肌醇激酶,由调节亚基p85和催化亚基p110构成,与细胞膜上的磷脂酰肌醇3磷酸相互作用,促进AKT的磷酸化。编码p110的PIK3CA基因的突变已经在许多肿瘤中被发现,包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和肝癌,导致激酶活性增加和肿瘤的发生。大量研究证实,PI3K/m TOR和Yap通路分别为肝癌发生强有力的驱动致癌基因。2012年一篇文献指出,激活的磷酸化的AKT与激活的Yap在人体肝癌标本中的表达呈现正相关关系,表明在肝癌的发生过程中,可能存在这两条通路的协同诱导激活。然而,到目前为止,关于PI3K/m TOR和Yap通路在肝癌的发生中是否存在相互作用尚未研究。在本研究中,我们观察PI3K/m TOR和Yap通路在小鼠肝癌发生中的协同作用,并阐述其发生的分子机制。观察这两条通路在人体肝癌标本的表达情况。方法:我们采用高压注射转染法,在小鼠肝脏中分别过表达激活型Yap S127A、突变型PIK3CAH1047R、Yap S127A和PIK3CAH1047R、Yap S127AS94A和PIK3CAH1047R、Yap WT和PIK3CAH1047R,观察对小鼠肝癌发生的影响。随后采用实时定量PCR、western blot和免疫组化的方法,描述PIK3CA/Yap诱导的肝癌的分子生物学特性,并阐述其发生的具体分子机制。同时,我们采用免疫组化方法,在人体54例肝细胞型肝癌标本、42例胆管细胞型肝癌标本及16例肝细胞和胆管细胞混合型肝癌中检测PIK3CA和Yap蛋白的表达情况,分析其表达与临床指标间的关系。在细胞实验中,我们使用PIK3CA特异性抑制剂PIK75,和Yap-TEAD结合阻断剂Verteporfin,或两者同时作用于人肝癌细胞系HLF和SK/Hep1,人胆管癌细胞系EGl1,观察对细胞增殖和凋亡的影响。结果:1、单独过表达Yap S127A22.5周后,并不能引起小鼠肝脏发生异常改变;单独上调PIK3CA的表达(PIK3CA小鼠)导致在整个肝脏实质上,大量富脂的肝脏细胞聚集成簇,但PIK3CA小鼠在注射40周后仍然不能形成肿瘤。与之形成鲜明对比的是,同时上调PIK3CA和Yap S127A的表达(PIK3CA/Yap小鼠),在注射10周至13周时,导致肝癌的的快速发生。2、镜下观察发现,PIK3CA/Yap小鼠的肝脏80%为肿瘤组织,余下的肝组织为富脂的肝细胞和正常肝细胞。值得注意的是,PIK3CA/Yap小鼠肝癌可以分为3种:单纯的肝细胞型肝癌、单纯的胆管细胞型肝癌和混合型肝癌。3、在小鼠肝脏同时过表达Yap WT和PIK3CAH1047R、或Yap S127AS94A和PIK3CAH1047R13周后,均不能诱导肝癌的的发生。4、实时定量PCR和western blot结果发现,PIK3CA/Yap肿瘤中肝癌标志物AFP、GPC3和Ep CAM均表达升高,肿瘤细胞代谢调控基因HK2、PKM2、FASN、ACAC表达升高,肿瘤细胞周期和增殖调控基因cyclin B1、cyclin D1、cyclin E1和c-Myc表达增加、肿瘤增殖抗原Ki67表达上调。5、免疫组化结果发现,PI3K/m TOR通路中p-AKT、p-m TOR、p-RPS6及其下游靶基因FASN、ACAC、p-NDRG1;Notch通路中Notch2、下游分子SOX9,ERK/MARP通路中p-ERK1/2在PIK3CA/Yap肿瘤中表达明显增强。6、在人体肝癌标本中免疫组化染色发现:在54例HCC中,PIK3CA和Yap蛋白分别在23例(42.6%)和38例(70.4%)标本中表达阳性。同时,在23例PIK3CA表达阳性的标本中,有17例(73.9%)的标本同时呈现出Yap蛋白的核内聚集;在42例ICC中,PIK3CA在24例(57.1%)的标本中表达升高,而Yap在所有ICC标本中均表达阳性;在16例混合型肝癌中,PIK3CA在11例(68.8%)标本中表达阳性,Yap在14例(87.8%)标本中表达明显升高。此外,PIK3CA和Yap在10例(62.5%)混合型肝癌标本中同时表达升高。然而,PIK3CA和Yap在HCC、ICC和混合型肝癌中的表达与临床指标,包括病因、是否伴有肝硬化、AFP水平、肿瘤大小、肿瘤分期之间无相关性。7、使用PIK3CA特异性抑制剂PIK75和Yap-TEAD结合阻断剂Verteporfin均可抑制人肝癌细胞系HLF和SK/Hep1,人胆管癌细胞系EGl1的增殖、并诱导凋亡。值得注意的是,同时给予PIK75和Verteporfin处理,进一步抑制细胞的增殖,但并未进一步诱导凋亡。结论:1、PIK3CA和Yap在小鼠和人的肝癌发生中发挥重要的协同作用。2、PIK3CA和Yap通过激活下游的AKT/m TOR、ERK/MAPK和Notch通路诱导小鼠肝癌的发生。3、联合抑制PI3K/AKT/m TOR和Yap通路,可能对Yap和PI3K/AKT/m TOR被异常激活的肝癌是一个有效的治疗方法。目的:失调的脂肪酸合成,即脂肪酸的从头合成是肿瘤的标志性特征之一。它为快速增殖的肿瘤细胞持续提供细胞膜、能量产生和蛋白转录后脂质修饰所必需的脂类和前体物质。在分子水平上,脂肪酸的从头合成体现在肿瘤细胞内参与脂肪酸合成的关键酶的明显升高,如柠檬酸裂解酶(ACLY)、乙酰辅酶A羧化酶(ACAC)、脂肪酸合成酶(FASN)、硬脂酰Co A去饱和酶1(SCD1)。FASN是催化从乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成长链脂肪酸的关键酶,是目前在肿瘤中研究最为深入的参与脂肪酸合成的蛋白分子。FASN在许多肿瘤中表达升高,并和肿瘤的恶性生物学特性和不良预后密切相关。其次,FASN在许多组织的癌前病变和肿瘤的侵袭前病变中表达升高。另外,许多体内和体外模型证实,阻断FASN可以抑制肿瘤的增殖,促进凋亡。最后,FASN的过表达促进转基因小鼠前列腺肿瘤的发生,说明它在前列腺癌中可能是一个驱动致癌基因。同样,过表达FASN使非肿瘤性乳腺细胞系发生恶性转变。在肝癌中,参与脂肪酸合成的关键酶,包括FASN,与肿瘤的发生发展密切相关。在化学诱导和激素诱导大鼠肝癌模型的肝脏癌前病变中,FASN表达上调。FASN和其它参与脂肪酸合成的蛋白的表达水平与肝癌患者的不良预后相关。另外,细胞实验表明,抑制FASN可以显著抑制肝癌细胞的增殖。所有关于FASN与肝癌的功能研究都是建立在肝癌细胞基础上进行的。尽管有这些证据,FASN在肝癌发生中的关键问题尚未得到解答。因此,关于FASN是否在体内模型中促进肝癌的发生和进展尚不清楚。方法:我们采用高压注射转染法,在小鼠肝脏中单独过表达FASN,或同时过表达致癌基因Ras、c-MET或SCD1,观察FASN在小鼠肝脏的致癌潜能。通过高压转染法将激活的AKT在FASN或Rictor肝脏特异性敲除的小鼠中过表达,观察敲除FASN或Rictor对AKT诱导的肝脏脂肪沉积和肝癌发生的影响。在肝癌细胞系中采用特异性小干扰RNA或化学抑制剂沉默FASN的表达,阐明FASN调控肝癌发生的分子机制。最后,采用免疫组化染色方法检测FASN、Rictor和p-AKT在人体肝癌标本中的表达情况。结果:1、在小鼠肝脏单独过表达FASN,或同时过表达参与肝癌发生的其它基因,均不能诱导肝脏组织发生形态学变化。2、敲除FASN,完全抑制AKT诱导的小鼠肝脏脂肪沉积和肝癌的发生,并抑制AKT的激活。3、在人的肝癌细胞系中,通过si RNA或抑制剂C75沉默FASN的表达,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,同时抑制激活的AKT的表达。而AKT的激活受m TORC2的调控。4、在机制上,FASN通过不依赖于ELOVL5的方式,在转录后水平调控m TORC2关键成员Rictor表达,进而调控AKT的激活。5、敲除Rictor,可以抑制AKT的激活,完全阻断AKT诱导的小鼠肝脏脂肪沉积和肝癌的发生。过表达Rictor,可以缓解沉默FASN对肝癌细胞增殖的抑制作用。6、与周围正常肝组织相比,FASN、p-AKT和Rictor分别在81.8%、60.2%、21.6%的肝癌组织中表达明显升高。重要的是,在所有过表达p-AKT和Rictor的肝癌组织,FASN的表达也同样明显升高。同样,所有Rictor表达阳性的肝癌标本,p-AKT表达也明显升高。而且,过表达FASN、p-AKT、Rictor的肝癌组织中分别有61.1%、66.03%和63.1%属于预后更差的一类,这说明这些蛋白的高表达与肝癌患者的不良预后有关。FASN、p-AKT、Rictor在肝癌组织的表达与肝癌的临床病理特征间没有关系。结论:1、FASN在小鼠肝脏中不是一个驱动致癌基因。2、FASN的表达是AKT诱导肝脏脂肪化和肝癌发生所必须的。3、FASN通过转录后水平调控Rictor的表达,进而调控AKT的激活。4、通过药物方法抑制FASN,对伴有AKT或Rictor激活的肝癌患者可能产生很好的治疗效果。


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