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天麻素的神经保护作用及其分子机制研究

彭正午  
【摘要】:【背景】天麻为兰科属植物,其块茎可以入药。中医认为,天麻性味甘、平,入肝经。具有息风、定惊的功效,可用于治疗眩晕眼黑,头风头痛,肢体麻木,半身不遂,语言蹇涩,小儿惊痫动风。近来的药理学研究显示,天麻具有抗惊厥、镇静、止痛、益智和抗炎作用,还可以改善循环,可以用于治疗多种心血管疾病,包括偏头痛、癫痫和抑郁症。作为其主要药学成分,天麻素已被发现可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对小胶质细胞抑制诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2)和促炎性细胞因子细胞因子表达的上调作用,我们的已往研究也发现天麻素可以改善增强单次延长应激(enhanced single prolonged stress,ESPS)所致大鼠的焦虑样行为,而且这一作用与其降低海马IL-6、IL-1β水平,抑制iNOS表达和p38 MAPK磷酸化水平有关。此外,最近的研究表明,天麻素也具有抗氧化作用[16],其可以通过激活ERK2/1-Nrf2通路,上调过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶的活性(SOD),抑制原代培养大鼠海马神经元对β-淀粉样肽诱导的神经毒性。因此,天麻素也可能通过抑制炎症相关通路上调机体的抗氧化水平从而维持大脑结构和功能的完整性以发挥其抗抑郁和神经保护作用。【目的】1.观察天麻素对慢性不可预见应激(cus)大鼠抑郁样行为的改善作用及对海马和海马星形胶质细胞脑源性神经营养因子(bdnf)表达的影响。2.观察天麻素的抗炎效应以及其对抑郁样行为和海马神经干细胞增殖的影响。3.观察天麻素对脑缺血再灌注小鼠的神经保护作用研究。【方法】1.构建抑郁大鼠模型,给予不同剂量的天麻素干预,持续2周。随后,通过强迫游泳实验和糖水偏好实验检测各组大鼠的抑郁样行为,在行为学检测结束后,处死大鼠,通过免疫组化和westernblot检测大鼠海马神经胶质酸性蛋白(gfap)和bdnf的表达情况。通过原代培养获得海马星形胶质细胞,给予不同剂量天麻素(sham、5、10、20、50和100μg/ml)48或72小时后,观察天麻素对星形胶质细胞活力、erk磷酸化和bdnf水平的作用,并通过去血清培养,观察不同剂量天麻素对星形胶质细胞的保护作用。2.大鼠适应性饲养10天:自由摄食和饮水,饲养环境为恒温恒湿,通过灯光调节昼夜转换循环(12:12小时)。随后,大鼠随机分为对照组(sham),对照+低剂量天麻素组(50mg/kg)、对照+中剂量天麻素组(100mg/kg)、对照+高剂量组天麻素组(200mg/kg)以及模型组(cus),模型+天麻素低、中、高剂量组(50、100或者200mg/kg),每组12只。对照组以及对照+不同剂量天麻素组不进行cus造模,但是每天腹腔注射生理盐水或者不同剂量天麻素,连续14天;模型组以及模型+不同剂量天麻素组进行cus造模,并且在造模结束后,每天腹腔注射生理盐水或不同剂量的天麻素(50、100或者200mg/kg),持续14天。各处理腹腔注射生理盐水或者天麻素的时间均为上午9:00至10:00。随后,每组大鼠中的一部分(n=8)进行旷场实验和强迫游泳实验,在行为学测试后处死大鼠,通过免疫组化和westernblot、elisa检测大鼠海马细胞增殖情况,蛋白表达和il-1β释放水平。其余部分大鼠(n=4)用于morris水迷宫测试。在造模每周末以及天麻素干预结束后测量体重。离体实验:对离体培养的神经干细胞添加不同剂量的天麻素(0、5、10、20、50μg/ml),作用3天或5天后,观察细胞活力。此外,在细胞克隆球的细胞培养体系加入终浓度为10ng/ml的il-1β,作用2小时后再加入不同剂量的天麻素,作用24或48小时后,通过brdu染色和细胞活力测试观察天麻素的保护作用。3.小鼠适应性饲养10天后,机分为以下5组:对照组(sham),模型组(mcao+vehicle),模型+天麻素低、中、高剂量组,即mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)。对照组和模型组在实验过程中腹腔注射生理盐水,mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)则分别注射10、50和100mg/kg体质量的生理盐水,注射液体量为0.1ml/kg体质量。(1)为了观察天麻素对mcao损伤的保护作用,sham组行假手术:水合氯醛麻醉后,取右颈部切口,逐层分离肌肉暴露右侧颈总动脉。1小时后腹腔注射生理盐水,缝合创口。mcao+vehicle组经mcao干预1小时后,腹腔注射生理盐水,拔出线栓,缝合创口。mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)与mcao组干预方式相似,但是注射了不同剂量的天麻素。在缺血24小时后进行神经功能评分,随后处死动物,取部分小鼠的缺血侧半脑进行westernblot或mda和sod检测,其余小鼠灌注固定后,取大脑冰冻切片,进行nissl染色。(2)为了观察天麻素在mcao延迟期的作用,sham组假手术1小时后,腹腔注射生理盐水,缝合创口,并在随后的6天,同一时间点注射等剂量的生理盐水。mcao+vehicle组的干预方式与sham组相似,但是经mcao造成缺血再灌注。mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)与mcao组干预方式相似,但是注射了不同剂量的天麻素。在最后一次注射生理盐水或天麻素24小时后,对各处理组小鼠进行神经功能评分,随后处死动物,取部分小鼠的缺血侧半脑进行westernblot或mda和sod检测,其余小鼠灌注固定后,取大脑冰冻切片,进行nissl染色。(3)为了观察天麻素对mcao急性期所致氧化应激和炎症水平的抑制作用,5组小鼠造模和给药方式同3.1,但不同的是在缺血6小时后再进行相关指标的检测。【结果】(1)慢性不可预见应激(cus)可以导致明显的抑郁样行为,包括糖水偏好减少和强迫游泳不动时间增加,cus还显著抑制了海马gfap和bdnf的表达水平。而一定剂量(100和200mg/kg)天麻素慢性干预可以缓解上述情况。此外,天麻素直接干预并不影响海马星形胶质细胞活力,但是20μg/ml剂量条件下对去血清损伤有一定的保护作用,对星形胶质细胞ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF的表达具有调节作用。(2)天麻素缓解CUS所致大鼠体重减轻,但是对运动能力没有显著作用。天麻素缓解CUS所致大鼠抑郁样行为和空间记忆损伤,抑制了CUS所致大鼠血浆IL-1β和IL-6水平和海马炎性通路的表达水平上调,还可以上调海马BDNF和GDNF的表达水平和海马的增殖。此外,天麻素直接干预并不影响海马神经干细胞活力,但是10μg/ml和20μg/mll剂量条件下对IL-1β所致细胞活力损伤有一定的保护作用。(3)天麻素干预(50和100 mg/Kg)减少了MCAO所致小鼠急性期及延迟期脑梗死容积,并且改善其神经功能评分;缓解了MCAO所致小鼠大脑的形态学损伤并抑制了大脑的凋亡相关蛋白的表达,此外,上述剂量条件下的天麻素干预抑制了MCAO所致小鼠急性期大脑氧化应激水平,并且抑制了促炎性细胞因子的表达情况。【结论】1.一定剂量的天麻素对CUS所致抑郁样行为具有改善作用,这一作用可能与天麻素维持海马星形胶质细胞的活性,上调ERK1/2磷酸化和BDNF的表达水平有关。2.天麻素对抑郁样行为的改善作用可能与其抑制促炎性细胞因子水平,抑制炎症相关通路,改善海马神经发生和维持神经干细胞活性有关。3.天麻素通过其抗炎和抗氧化作用,对缺血性脑损伤具有保护作用。


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