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牙髓干细胞克隆差异及其应用于神经和平滑肌再生方面的初步研究

蒋文凯  
【摘要】:牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)是一类由神经脊发育而来,位于牙髓组织中的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)。它具有自我更新能力和多向分化潜能,不仅能被诱导分化为间充质来源的细胞类型,包括成骨细胞,成牙本质细胞,成脂细胞,成软骨细胞等,还有向内皮,肌肉,肝细胞,黑色素细胞等多个方向分化的潜能。近20年关于DPSCs的研究和应用极大推动了组织工程和再生医学的发展。当DPSCs应用于组织工程和干细胞治疗时,它的体外增殖能力和多向分化潜成为了关键性因素。随着对DPSCs研究的深入,大量研究发现来源于不同供体的DPSCs展现了截然不同的特性,即使来源于同一供体的不同克隆之间,其特性也差异较大。因此,通过体外分离、筛选、比较不同克隆间的增殖能力和多向分化潜能,并从中挑选出一株具有最佳增殖能力和分化潜能的DPSCs克隆,将为组织工程的研究打下良好的基础。平滑肌是一种非自主的非横纹肌组织,它在人体全身多个脏器中发挥了重要作用。由于自身系统性疾病以及外源性创伤所造成的平滑肌组织损伤和功能障碍极大影响着人的日常生活,甚至威胁到人的生命。神经系统包括外周和中枢神经系统。通常情况下,神经损伤是不可逆的。而神经损伤后所造成的一系列功能障碍极大影响了人的日常生活。组织工程和再生医学的发展和应用为平滑肌再生和神经再生带来了希望,而作为组织工程中种子细胞的重要来源之一的dpscs,其是否具有向神经和平滑肌方向分化的潜能,以及具体的体外诱导方法和分子调控机制,目前尚不清楚。本研究以dpscs作为研究对象,在体外培养条件下,分析、比较从不同供体中分离出来的dpscs单克隆体外增殖能力以及多向分化潜能,从中挑选出一株具有最佳特性的克隆,并进一步研究其向神经方向和平滑肌方向分化的诱导方法和分子调控机制,从而为平滑肌再生组织工程和神经再生组织工程提供一定的基础研究理论。主要研究结果如下:1.dpscs不同克隆间的分离,筛选与比较通过纤维连接蛋白筛选法从3个不同供体中筛选出4株dpscs克隆,通过群体倍增法(populationdoublinglevel,pdl)比较它们的体外增殖能力;通过体外成骨诱导、成脂诱导、成软骨诱导比较它们的多向分化潜能;通过半定量pcr检测它们不同代数mscs表面标记物的表达情况。通过比较筛选出一株dpscsa32克隆,它能在体外增殖约300天,并同时具有成骨、成脂、成软骨分化的潜能。将具有最佳体外增殖能力和多向分化潜能的a32克隆作为后续平滑肌再生、神经再生组织工程研究的种子细胞。2.dpscsa32克隆在平滑肌组织工程方面的研究和应用。体外分离平滑肌细胞(smoothmusclecells,smcs),获取smcs的条件培养液(conditionalmedium,cm)。通过比较,筛选出smcs体外诱导培养液的最佳配方和浓度。通过形态学观察以及smcs表面标记物基因和蛋白表达检测,证明在含有转换生长因子β-1(transforminggrowthfactorβ-1,tgf-β1)和smcscm的smcs体外诱导培养液作用下14天,a32能分化为成熟的smcs样细胞,并进一步证明通过延长诱导时间,a32能分化为平滑肌层样细胞形态。接着,本研究进一步分析了a32向smcs分化过程中的分子调控机制,发现经典wnt通路不仅能通过调控生长因子tgf-β1、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,hgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)、血小板来源生长因子-bb(platelet-derivedgrowthfactor-bb,pdgf-bb)等的表达,促进a32分化为成熟smcs,还能通过调控碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bfgf)和表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)的表达,维持A32干细胞特性。3.DPSCs A32克隆在神经再生组织工程方面的研究和应用。体外通过两步法诱导A32向神经元方向分化。通过形态学观察以及不同阶段神经表面标记物基因和蛋白表达检测,证明在第一阶段,在神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)体外诱导培养液的作用下,A32能分化为类似于NSCs样细胞形态,并呈现神经球样聚团生长;在第二阶段,在含有不同类型神经营养因子的神经元体外诱导培养液的作用下,A32能进一步分化为类似于神经元样细胞形态。本研究还进一步分析了A32神经分化过程中,不同阶段神经表面标记物的表达,以及不同类型的生长因子(TGF-β1、bFGF、EGF)和神经营养因子(脑来源神经营养因子(Brain-Derived Nurotrophic Factor,BDNF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)、神经营养因子-3(Neurotrophin-3,NT-3))的作用。综合以上的研究,本课题对DPSCs不同克隆间的特性,以及DPSCs向神经和SMCs分化的体外诱导方法和分子调节机制做了初步的探索和研究。这些研究结果有助于我们进一步揭示DPSCs的干细胞特性,并且为平滑肌再生组织工程和神经再生组织工程提供一定的基础研究理论。


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