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线粒体分裂与钙信号交互作用促进肝癌转移的作用机制研究

曹海燕  
【摘要】:[研究背景]线粒体是细胞的“动力工厂”,供应细胞生存所需能量,氧自由基(ROS)产生、钙离子稳态、,除产生大量的ATP外、其在调节活性氧(ROS)产生、细胞色素C释放介导的细胞凋亡、Ca~(2+)信号传导的调节等多种生物学功能中发挥关键作用。最新的研究表明:在多种类型细胞中,线粒体通过可不断的分裂融合改变其形状进而适应各种环境刺激并满足细胞功能需求。哺乳动物细胞中参与线粒体分裂的蛋白主要包括Drp1(dynamin-related protein-1)及其受体蛋白(FIS1、MFF、Mi D49和Mi D51),参与融合蛋白主要包括外膜融合蛋白MFN1(mitofusin1)、MFN2(mitofusin 2)和内膜融合蛋白OPA l(opticatrophy 1)。近日,大量研究表明线粒体动态失衡与肿瘤的发生发展密切相关。一些研究报告显示,线粒体分裂/融合蛋白如DRP1,MFN1和MFN2的表达在肺癌、膀胱癌和乳腺癌中严重失衡,线粒体结构的破坏对肿瘤细胞凋亡有重要影响。此外,研究表明肺癌患者预后较差与线粒体动力相关蛋白表达失衡显著相关。我们前期研究表明,在肝癌组织DRP1表达上调,而MFN1表达下调,进而使线粒体分裂显著增加。此外,我们已经发现,线粒体分裂增加可通过ROS介导的NF-κB/p53信号通路促进肝癌细胞自噬和细胞存活。钙离子是细胞内最主要的第二信使之一,并参与调控几乎所有的细胞生命活动。研究表明,钙池操控的钙摄取是非兴奋性细胞最主要的钙流入途径。该过程主要由内质网上的钙感受分子STIM1和细胞膜上的钙通道蛋白Orai1共同介导完成。钙信号的各种变化可被细胞解码,进而参与调控包括肿瘤细胞侵袭转移在内的多种细胞活动。目前,线粒体分裂融合是否参与调控胞浆钙信号以及是否影响在肝癌细胞迁移和转移目前尚不明确。[研究目的]1、明确线粒体分裂融合与胞浆钙离子之间存在交互调控环路;2、探讨线粒体分裂融合与胞浆钙信号交互调控的分子机制;3、明确线粒体分裂融合与胞浆钙信号交互调控环路调控肝癌转移的作用机制。[研究方法]1、利用线粒体特异性染料Mitotracker Green和胞浆钙离子特异性染料Fluo-4,检测线粒体动态平衡与胞浆钙信号之间的交互调控关系;2、利用Western blot和q PCR技术检测线粒体分裂融合相关分子及其调控的相关信号通路分子的蛋白及mRNA转录水平变化;3、利用流式细胞术证实线粒体分裂融合可调控胞浆内ROS水平;4、利用免疫组化技术检测线粒体分裂融合相关蛋白与SOCE重要调控分子STIM1之间的相关性;5、利用免疫荧光和鬼笔环肽染色技术检测线粒体分裂融合与胞浆钙离子交互调控环路对肝癌细胞粘着斑和伪足形成的影响;6、利用Transwell实验检测线粒体分裂融合与胞浆钙稳态失衡可调控肝癌细胞的侵袭能力;7、利用载体构建和荧光素报告检测技术检测线粒体分裂关键分子Drp1和FIS1的转录因子位置;8、利用公共数据分析调控线粒体分裂关键分子Drp1和FIS1转录的转录因子有哪些;9、利用裸鼠肝原位成瘤技术检测线粒体分裂关键分子Drp1对肝癌转移的影响;10、利用HE染色技术检测成瘤裸鼠肝癌肝内和肺组织转移情况;[研究结果]1、线粒体形态和胞浆钙信号检测结果表明线粒体分裂与胞浆钙信号可正反馈交互调控;2、细胞内ROS水平检测结果表明线粒体分裂可促进胞浆钙信号水平激活;3、Western blot和q PCR实验结果显示线粒体分裂与胞浆钙信号可通过Ca MKII/ERK/FAK信号通路调控肝癌转移情况;4、转录因子预测实验结果显示胞浆钙信号通过调控Drp1和FIS1转录的转录因子的表达来调控线粒体分裂融合状;5、进一步免疫组化结果表明在肝癌组织中Drp1与STIM1分子表达显著正相关,而MFN1分子与STIM1分子表达显著负相关;6、同时粘着斑和细胞骨架检测结果进一步表明线粒体动态与胞浆钙稳态失衡正反馈交互调控环路可缩短肝癌细胞粘着斑的生成周期并且可促进伪足的形成;7、Transwell实验结果表明线粒体分裂与钙信号交互调控环路可促进肝癌细胞的侵袭;8、裸鼠肝原位成瘤结果及成瘤裸鼠肝肺组织HE染色结果表明线粒体分裂与钙信号交互调控环路可促进肝癌转移;[研究结论]本研究明确了线粒体分裂与钙信号存在正反馈交互调控环路,并且这一环路可以促进肝癌的侵袭转移能力。


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