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肠道菌群对肿瘤免疫微环境中抗原提呈细胞功能的影响

许承明  
【摘要】:【背景】越来越多的研究证据表明,肠道菌群参与调节了机体的多种生理和疾病过程,是以往研究所忽视的一个重要“器官”。人体的肠道细菌数量达到1013级别,几乎等同于自身体细胞的数量。由600多种共生细菌构成的肠道菌群的结构和代谢状态极容易受到饮食,抗生素等因素的影响。而肠道菌群的差异会对宿主产生不同的作用,从而影响到炎性肠病,糖尿病,自身免疫性疾病,甚至自闭症等疾病的发生和发展。新近的研究结果提示,一些特定的化疗和免疫疗法对肿瘤的治疗效应依赖于完整肠道细菌的存在,提示肠道菌群和远端肿瘤之间存在一定的联系。虽然免疫系统是介导肠道菌群和肿瘤间联系的首要考虑途径,但是对于肠道菌群中参与调节肿瘤免疫微环境的细菌或成分,以及介导肠道菌群对肿瘤微环境产生影响的免疫细胞类型和具体的调节机制,现有研究未能提供清晰的理解。而对肠道菌群影响肿瘤免疫微环境的方式和具体机制的研究,一方面可从整体系统的角度为免疫系统发挥抗肿瘤效应机制提供新的理解,同时对以肠道菌群为靶点,开发调节肿瘤免疫微环境的新型治疗方式有着重要意义。【目的】通过广谱抗生素剔除小鼠肠道菌群,观察肠道菌群缺失对小鼠抗肿瘤免疫功能的影响,发现参与介导菌群对肿瘤免疫监视功能影响的免疫细胞类型,研究潜在菌体成分对参与介导的免疫细胞的具体影响和调控方式。【实验方法和结果】1.联合抗生素对小鼠肠道菌群的影响方法:广谱抗生素Ampicillin,Neomycin,Vancomycin联合(ABX)饮水处理小鼠,观察处理对小鼠消化道外观的影响,检测抗生素处理前,处理后,撤出抗生素后小鼠粪便中细菌YCFA培养基培养后CFU数量,鲎试剂显色法检测血清LPS水平,16s r DNA测序分析肠道菌群结构和多样性。结果:ABX饮水处理可将C57BL/6小鼠肠道可培养细菌降低至1 CFU/100 mg以下,破坏肠道细菌的结构,使拟杆菌门的比例大幅降低而厚壁菌门细菌比例显著升高,同时使肠道菌群的多样性下降,血液中的LPS浓度下降;抗生素剔除肠道细菌后盲肠外观膨大,与无菌动物类似;撤出抗生素后,肠道细菌的数量、结构、多样性以及血液LPS水平在6天时间内逐渐恢复,其中血液LPS水平在撤出抗生素后3天即完全恢复。2.抗生素剔除菌群对小鼠抗肿瘤免疫功能的影响方法:在肿瘤接种前后不同的时间段给予抗生素饮水处理:预先2周开始联合抗生素(ABX)饮水处理至实验结束;抗生素预先处理而接种肿瘤后停止处理(ABX-Pre);接种肿瘤后再给予联合抗生素的处理(ABX-Post)。与正常饮水对照组比较观察不同处理对B16F10皮下接种肿瘤生长的影响。抗生素预先处理小鼠,接种肿瘤48小时后,RT-q PCR检测肿瘤中IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35和CD80,CD86和MHCⅡ表达水平,流式细胞术检测肿瘤局部和脾脏中CD11c+MHCⅡ+和CD11b+MHCⅡ+细胞比例,ELISPOT法检测TRP2刺激后脾细胞中分泌IFN-γ细胞频数,结晶紫染色法检测脾细胞和脾脏NK细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤能力。结果:预先联合抗生素(ABX)饮水处理的小鼠接种肿瘤细胞后发生肿瘤的速度加快,抗生素预先处理而接种肿瘤后停止处理(ABX-Pre)的小鼠肿瘤发生速率也有加快的表现,而接种肿瘤后再给予联合抗生素的处理方式(ABX-Post)不能对后续接种肿瘤的生长产生影响。接种后48小时,抗生素处理小鼠皮下的肿瘤中IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35、CD80、CD86及MHCⅡ的m RNA水平较低。抗生素处理组肿瘤浸润的CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD11c+MHCⅡ+细胞和CD11b+MHCⅡ+细胞的比例均低于对照组;同时,ABX组小鼠脾脏细胞中上述细胞的比例也较低,在TRP2抗原刺激后分泌IFN-γ的细胞频数较低,脾脏细胞和从中分离的NK细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤效应没有发生变化。3.菌体抗原补充对缺失菌群小鼠抗原提呈细胞功能的影响方法:皮下荷瘤小鼠模型中肿瘤接种前给予DC注射,肿瘤注射后分别给予LPS或生理盐水腹腔注射一次;抗生素处理小鼠分别通过口服和腹腔注射途径给予LPS,观察记录肿瘤生长情况。检测不同LPS处理途径对肿瘤局部IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35 m RNA水平,CD11c+MHCⅡ+和CD11b+MHCⅡ+细胞比例,以及肠道IL-1β、IL-6、IL-10、F4/80、CD11c、CD11b、MHCⅡm RNA水平的影响。体外培养骨髓来源树突状细胞(BMDC)和骨髓来源单核细胞(BMMo),加入LPS刺激后流式细胞检测细胞膜表面CD80、CD86和MHCⅡ分子的表达水平,ELISA法检测培养上清中IL-12水平。将加入LPS刺激后BMDC和BMMo及未刺激的对照组细胞与T细胞共培养,检测T细胞增殖和上清IL-2分泌水平。结果:LPS可增强DC对小鼠皮下移植肿瘤生长的抑制。相比于腹腔注射,口服途径补充LPS可降低ABX处理小鼠肿瘤瘤体大小,提高肿瘤局部IFN-γ,TNF-α,IL-12p40,IL-12p35水平和CD11c+MHCⅡ+和CD11b+MHCⅡ+细胞比例,LPS灌胃处理组小鼠肠道IL-1β因子及F4/80,CD11c,CD11b,MHCⅡ的m RNA均回复至对照水平。LPS可使体外诱导培养的两种主要抗原提呈细胞BMDC和BMMo细胞膜表面的CD80和CD86表达上调,促进两类细胞IL-12的分泌。LPS刺激后的BMMC和BMMo和T细胞共培养时,T细胞增殖增加,上清中IL-2水平较高。【结论】联合抗生素饮水处理可清除小鼠肠道大部分肠道细菌,破坏原有菌群结构,部分模拟无菌动物缺失肠道的状态,但这种影响是可逆的。预先清除肠道菌群会破坏小鼠正常的抗肿瘤免疫反应,降低抗原提呈细胞的数量和功能。而肠道细菌成分LPS灌胃途径的补充可提高抗原提呈细胞数量和功能,从而恢复抗生素剔除小鼠的抗肿瘤免疫功能。


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