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体外血脑屏障模型的建立及纳米药物的中枢靶向效应研究

孟凡荣  
【摘要】:体外血脑屏障模型的建立及纳米药物的中枢靶向效应研究研究目的:建立稳定、易重复的体外血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)模型,利用该模型,探索尺寸、表面性能等因素对纳米药物BBB通透性影响的相关规律。随后在该规律指导下合成并评价了高/低水溶性纳米药物的BBB通透性,为中枢靶向纳米药物研究提供指导。研究方法:1、采用2w龄的SD大鼠,经II型胶原酶和胶原酶/分散酶两次酶消化、大鼠脑微血管内皮细胞分离液高速离心梯度分离,最终获取纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞(Rat brain microvascular endothelial cells,RBMECs),并通过VIII因子相关抗原对细胞进行免疫荧光鉴定,通过透射电子显微镜(TEM)观察细胞之间的紧密连接(TJ)。2、将5代以内的细胞接种到Transwell上室,待细胞生长融合后,采用经典的4h渗漏实验、跨内皮电阻(Trans Epithelial Electrical Resistance,TEER)实验、荧光素钠(Fluorescein disodium salt,FLU)通透性实验判定模型建立成功与否。随后采用可穿透BBB的标准阳性药物秋水仙碱(colchicine)和不能穿透BBB的阴性药物多柔比星(Doxorubicin,DOX)对该模型进行验证。3、利用建立成功的体外BBB模型筛选并评价不同尺寸、表面修饰的纳米颗粒、中枢靶向纳米药物和高脂溶性纳米药物(依托泊苷纳米颗粒)的穿透效果,总结相关规律。研究结果:1、经倒置相差显微镜观察分离、培养出的RBMECs呈典型的“铺路石”样形态并单层生长,VIII因子相关抗原鉴定结果显示分离培养的RBMECs纯度在90%以上。采用TEM下可清晰观察细胞间形成的紧密连接,表明RBMECs分离、培养成功。2、将RBMECs以一定的密度接种到Transwell6孔板的上室,在显微镜下观察待细胞融合后进行评价。4h渗漏实验示模型上室和下室能维持明显的0.5cm液面差,表明细胞层有明显的阻拦效应;跨内皮电阻实验(TEER)中有效电阻值可达到200~350Ω·cm~2,证明细胞层生长致密,满足屏障要求;评价对照药物荧光素钠、DOX等非中枢靶向性药物,其1h以内穿透(通透)系数均低于1.0?10~(-3)cm·min~(-1),能穿透BBB的药物秋水仙碱(colchicine)在1h内其穿透系数约为3.0?10~(-3) cm·min~(-1)。以上实验证明该模型通透性低,屏障功能完好,满足体外BBB模型的使用要求。3、(1)应用TEM和LSCM两种方式对穿透体外BBB模型的纳米颗粒进行定性评价,观察结果发现,5nm硅纳米颗粒(Si NP)和100nm经转铁蛋白修饰的硅纳米颗粒(Tf-Si NP)可能够穿透体外BBB模型,而100nmSi NP、360nmTf Si NP及360nmSi NP纳米颗粒均不能穿透体外BBB模型;(2)将中枢靶向纳米药物Tf-MSN-HI-6和重活化剂HI-6通过体外BBB模型评价,得出Tf-MSN-HI-6穿透系数为(6.3±0.7)×10~(-3)cm·min~(-1),HI-6的穿透系数为(1.2±0.2)×10~(-3)cm·min~(-1),前者是后者的5倍(P0.01)。(3)我们把高脂溶性的抗癌药物依托泊苷制备成纳米颗粒悬浊液后,药物的释放率显著增高,细胞的杀伤效果与普通的粉末和溶液相比大幅增强,并且对体外BBB模型仍具显著穿透效果。结论:1、在脑组织分离RBMECs中,通过选取合适周龄动物、两次酶消化、梯度离心到后期嘌呤霉素添加去除周细胞这种体系的细胞提纯方法,成功分离培养出高活力、高纯度的RBMECs;2、在BBB建模中,探索出关键核心影响因素,即原代高活力细胞的使用及“平、缓、稳”的细胞接种原则对整个Transwell的BBB模型的建立有着至关重要的影响,在此基础上,采用经典的4h渗漏实验、TEER实验等对其功能完成了一系列的评价和验证;3、创新性应用TEM和LSCM两种方式对穿透体外BBB模型进行定性评价。特别是采用LSCM,能够更为简单、清晰、直观的判断多大尺寸及带何种表面修饰的纳米药物能够穿透体外BBB模型,解决了纳米颗粒中枢靶向性难评价难表征的难题;4、合成不同尺寸及带有表面修饰的硅纳米颗粒,并通过体外BBB模型成功探索出穿透BBB的纳米颗粒所必须满足的规律和条件;5、在该规律指导下,使用纳米技术将不易穿透BBB的高水溶性药物和低水溶性的抗癌药物纳米化,经体外BBB模型评价,所设计与合成的药物均显示良好的中枢靶向性。


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