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构建再细胞化组织工程皮肤用于损伤修复的研究

郭宝林  
【摘要】:严重皮肤创伤或缺失,体液丢失过多,将面临休克、创面及全身感染等严重并发症甚至危及生命。修复皮肤大面积缺损最有效的方法依然是自体皮肤移植,缺点是可供移植的皮肤往往无法满足需求,寻求合适的皮肤替代物是解决这一难题的有效手段。利用组织工程的原理和技术构建自体来源皮肤替代物实现个性化治疗,是皮肤再生医学的研究重点。组织工程皮肤研究的三个核心问题是种子细胞、支架材料和体外三维构建。种子细胞是组织工程皮肤构建的基础,理想的种子细胞必须能够安全、稳定、迅速和大量扩增,以满足皮肤组织再生的需要。表皮干细胞具有自我更新及向表皮各层细胞分化的潜能,是构建组织工程皮肤良好的种子细胞来源。表皮干细胞位于基底层,其数量有限,因此如何快速促进表皮干细胞大量增殖是需要解决的首要任务。2009年Hans Clevers采用3D(Three-dimensional)培养方式成功培养出“mini-gut”类器官(Organoid),随后Organoid培养技术被广泛用于其他组织。Organoid培养体系的核心是要具有自我更新能力的干细胞,因此才能通过定向诱导分化产生对应器官的类器官,正是由于其干细胞核心的特性,所以类器官能够实现细胞的大量扩增,这就为构建自体来源的组织工程皮肤提供了可行性。支架材料是组织工程组织构建的保障。理想的组织工程支架材料应具备三维立体结构,可以为细胞迁移和生长提供良好的空间;与创面贴附紧密,促进细胞的输送与精确定位;无毒副作用、生物学相容性好。细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)与细胞间的相互作用可以影响细胞的命运。ECM主要由胶原、蛋白多糖、糖蛋白三种核心蛋白成分,以及所含有的ECM相关的调节因子、生长因子、细胞因子、酶等组分,是细胞生理活动所必需的物质。脱细胞皮肤的ECM结构与天然组织非常相似,且无免疫原性、可降解、具有优良的机械性能和生物相容性,能够为细胞生长提供三维空间,促进细胞粘附、增殖、迁移和分化,是理想的组织工程皮肤支架材料。而脱细胞策略决定着ECM成分的留存,直接影响脱细胞后ECM的生物学特性。实验室具有自主知识产权的“四步法”脱细胞体系,能够迅速、高效的制备肝脏脱细胞支架,支架保留了胶原蛋白的完整性和几乎所有ECM偶联的细胞因子,生物学活性优良,这为我们构建脱细胞皮肤基质材料奠定了坚实基础。基于上述内容,本课题共分为三个部分,第一部分制备脱细胞猪皮基质及其生物学特性鉴定;第二部分建立并优化人表皮类器官和成纤维细胞培养体系以及鉴定类器官表型鉴定;第三部分完成组织工程全层皮肤的体外构建并评价其促进小鼠皮肤损伤修复的功能。一、脱细胞猪皮基质的制备与鉴定我们成功制备了脱细胞猪皮基质(APSM),PLA2与SDC脱细胞组合用时短,效率高,脱细胞充分,电镜下的微观结构观察发现真皮胶原纤维和基底膜保留完整。ECM成分鉴定显示真皮主要构成胶原、糖蛋白和蛋白聚糖表达阳性,基底膜CollagenⅣ、Laminin、Nidogen及Perlecan四种基本构成表达阳性。胶原和蛋白聚糖定量分析进一步说明APSM的结构性胶原充分保留,蛋白聚糖类也可以有效存留。SDC残留量低,毒性小,细胞DNA残留少,免疫源性低。我们还对APSM进行基质组学(Matrisome)分析,APSM的基质蛋白大量富集,质谱结果显示149种ECM蛋白质,其中胶原、糖蛋白和蛋白聚糖三种“核心matrisome”保留种类丰富,“matrisome associated”的调节因子、分泌因子和相关蛋白丢失较多。脱细胞基质富集79个非matrisome或细胞的蛋白,可能是潜在的基质组学蛋白质。因此我们证实了“四步脱细胞法”稳定可靠,其优势是操作时间短,在遗传物质残留量少的同时,ECM成分得到最大限度的保留,可以作为构建组织工程皮肤的支架材料。二、人表皮类器官和成纤维细胞培养体系的建立及其鉴定我们成功的建立了人角质形成细胞(hKCs)的分离和3D类器官(Organoids)培养方法,相比传统过夜分离方法所获细胞活力更强;同时建立了新的人成纤维细胞(hFbs)分离方法。2D培养的hKCs呈现典型的多边形铺路石样形态,表达Integrinα6,CK14及转录因子P63等基底层干/祖细胞(Epidermal stem/progenitor cells,ESCs)标志,并且增殖能力标志Ki67表达阳性;少量细胞表达成熟细胞标志Involucrin。培养的hFbs呈长梭形,表达成纤维细胞标志Vimentin,以及少量表达内皮细胞标志VWF的多角形细胞。Organoids培养通过初步使用的10因素组合:N-2 supplement+B-27 supplement+N-Acetyl-L-cysteine+EGF+FGF10+Noggin+R-spondin1+Wnt3a+A83-01+Forskolin,成功培养出表皮Organoids。对培养体系进行优化,确定最优的培养组合是Nac+B27+EGF+Wnt3a+Fsk+A83-01,在NaBEWFs+A83-01(day2)条件下Organoids形成效率接近4%。经过24-28天培养细胞基因保持稳定,可扩增4000-5000倍左右。Organoids为实心圆球状,外层对应基底层表达干/祖细胞标志Integrinα6、Integrinβ4、转录因子P63、SOX9,以及角蛋白CK5、CK14,内层表达基底上层成熟细胞标志Involucrin、CK1、CK10,少量细胞表达黑色素细胞标志gp100,证实为表皮Organoids。此外,我们还证实Organoids来源于Integrinα6+++的KSCs,实现了细胞起源的精确定位。三、组织工程全层皮肤的体外构建和促进小鼠皮肤损伤修复的研究首先我们验证APSM微粉作为载体能够促进hKCs的粘附、增殖和干细胞特性维持,无细胞毒性、生物相容性好。筛选3D培养基(NaBEWFs+A83-01)能够有效支持表皮Organoids形成复层表皮。然后我们先后将成纤维细胞与表皮Organoids细胞接种到APSM上进行气液界面培养,成功构建了含有真皮成纤维细胞和表皮复层结构的组织工程全层皮肤,体外构建时间短,透射电镜下超微结构与正常皮肤组织相似,具有基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层以及细胞连接。动物实验,APSM及其构建的TE皮肤能够显著加快损伤小鼠的皮肤修复进程。修复早期减轻炎症反应,促进创面的再表皮化和创面下的血管生成、真皮的重塑、及毛囊等皮肤附属器的再生修复。综上所述,我们的脱细胞方法能够温和、快速有效的制备出性能优良的细胞外基质支架材料,优化了表皮细胞及真皮成纤维细胞的分离方法,建立并优化了表皮3D-Organoids培养体系,为使用自体皮肤细胞构建组织工程皮并用于促进损伤修复奠定了坚实的基础。


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