诸葛菜种子化学成分及生物活性研究

【摘要】：诸葛菜(Orychophragmus violaceus(L.)O.E.Schulz)是十字花科(Brassicaceae)诸葛菜属植物,一年生或越年生草本植物,主要分布在亚洲中部及东部,在我国分布广泛,别名二月兰。国内外对诸葛菜已有的研究报道表明,其植物中化合物种类主要包括黄酮类、酚酸类、三萜皂苷等,作为一个历史悠久的民间用药,具有抑制肿瘤、抗菌消炎、保护肝脏等生理活性。本课题组前期试验以人肝癌HepG2细胞株为体外抗肿瘤模型进行抗肿瘤试验,采用MTT法,发现诸葛菜种子总提取物有良好的抗肿瘤活性。本文在综述了十字花科近五年植物化学成分及生物活性研究的基础上,系统研究了诸葛菜种子的化学成分,对分离纯化得到的部分化合物进行体外抗肿瘤活性评价,并对新骨架化合物进行了体外抗辐射试验。将40 kg诸葛菜干燥种子,以240 kg 70%乙醇回流提取,重复提取3次,每次提取时间2 h,合并提取液,浓缩后得到总浸膏,浸膏经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,得到各萃取部位,分别对各萃取部位进行系统的分离纯化。本实验采用硅胶柱色谱、AB-8大孔吸附树脂柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱和制备HPLC等技术方法,得到了 71个化合物,通过化合物的理化性质及质谱、红外光谱、核磁共振谱等方法,共鉴定了其中53个化合物的结构。鉴定的化合物包括10个新化合物,分别为:诸葛菜碱A(1),诸葛菜碱B(2),诸葛菜碱C(3),诸葛菜素A(4),诸葛菜素B(5),诸葛菜素C(6),诸葛菜素D(7),诸葛菜龙脑苷A(8),诸葛菜皂苷A(9),诸葛菜苷B(10),其中化合物1-3为新骨架类型的生物碱,化合物4-7为四个异香豆素类化合物,化合物8为单萜苷,化合物9为二萜苷,化合物10为三萜皂苷;已知化合物43个,分别为甜叶悬钩子苷(11),密蒙花苷 C(12),3-O-α-L-鼠李糖-(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→3)-[β-D-葡萄糖-(1→2)]-β-D-岩藻糖-23,28-二羟基柴胡皂苷-11,13(18)-二烯(13),3β-O-(β-D-木糖-(1→2)-[β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→3)]-β-D-岩藻糖-23,28-二羟基柴胡皂苷-11,13(18)-二烯(14),密蒙花苷D(15),密蒙花苷E(16),密蒙花苷F(17),醉鱼草皂苷Ⅰ(18),醉鱼草皂苷Ⅲ(19),醉鱼草皂苷Ⅰa(20),醉鱼草皂苷Ⅲa(21),苯甲酸(22),2-羟基苯甲酸(23),4-羟基苯甲酸(24),4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(25),3,4,5-三甲氧基苯甲酸(26),7-羟基-6-甲氧基香豆素(27),5,7-二羟基色原酮(28),7,8-二甲基吡嗪(29),芫花素(30),蒙花苷(31),异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(32),芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(33),金圣草黄素-7-O-β-D-葡萄糖苷(34),金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷(35),染料木素(36),5,7,3',5'-四羟基二氢黄酮(37),5,7,3',5'-四羟基-二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(38),香橙素-7-O-β-D-葡萄糖苷(39),橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(40),1,3-二羟基蒽醌(41),落叶松树脂醇(42),落叶松树脂醇-9-O-β-D-吡喃型葡萄糖苷(43),异落叶松树脂醇-9-O-β-D-吡喃型葡萄糖苷(44),正十六烷酸(45),正二十一烷酸(46),薯蓣皂苷(47),纤细薯蓣皂苷(48),β-谷甾醇(49),胡萝卜苷(50),β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷-20-0-棕榈酸酯(51),白桂木内酯B(52),长寿花葡萄糖苷(53)。除化合物22、37及50外,其余化合物均为首次从诸葛菜属中分离得到。从诸葛菜种子中分离得到一系列2-哌嗪酮骈合2,4-二羰基-1,3,5-三嗪结构类型的生物碱,这是自然界中首次发现的新骨架类型。此外还有新的异香豆素、黄酮、三萜皂苷类化合物等,极大地丰富了该属植物的化学成分,为诸葛菜植物化学成分研究和开发利用奠定基础。采用MTT法,对分离得到的部分化合物进行体外抗肿瘤活性评价。以人肝癌HepG2细胞株、人结肠癌HCT-116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株和人肺腺癌A549细胞株为肿瘤模型,对分离得到的生物碱类新化合物1-3进行体外活性筛选,结果发现化合物1显著抑制肿瘤细胞生长,对人肝癌HepG2细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人宫颈癌Hela细胞株和人结肠癌HCT-116细胞株的抑制效果非常明显,其IC50值分别为7.73,10.79,11.91和9.93μM;以人结肠癌HCT-116细胞株和人宫颈癌Hela细胞株为肿瘤模型,对分离得到的异香豆素类新化合物4-7进行体外活性筛选,结果发现化合物4显著抑制肿瘤细胞生长,对人结肠癌HCT-116细胞株和人宫颈癌Hela细胞株的抑制效果非常明显,其IC50值分别为5.10和8.91 μM,化合物5和6的IC50值在10.12到28.30 μM之间;对化合物4进行了初步的抗肿瘤活性机理研究,即通过流式细胞仪检测化合物4对HCT-116细胞周期和DNA含量的变化的影响,通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测化合物4对HCT-116细胞凋亡的影响。结果表明,随着药物浓度的升高,化合物4将HCT-116细胞周期阻滞在G2期,并显著增加了细胞凋亡,其细胞毒作用可能是通过诱导细胞凋亡产生的。以人肝癌HepG2细胞株和人肺腺癌A549细胞株为肿瘤模型,对分离得到的三萜皂苷类化合物9-21进行体外活性筛选,结果发现化合物9,12,15,18,19显著抑制肿瘤细胞生长,化合物18和19的IC50值在0.48到1.06 μM之间,新化合物9的IC50值分别为7.13和8.77 μM。另外,对化合物1-3进行体外抗辐射筛选,采用60Coγ辐照的人脐带静脉上皮细胞株(HUVEC)为模型,结果表明,当浓度为10 μM时,化合物3将辐射后HUVEC 细胞株的存活率从(56.71 ± 0.92)%提升到(77.64 ± 1.19)%(P0.01,GraphPad Prism 5)。