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产KPC的肺炎克雷伯菌耐药质粒研究

冯娇  
【摘要】:肺炎克雷伯菌是临床上常见的条件致病菌之一,可引起不同部位的院内感染。碳青霉烯酶是一类可水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶,包括Ambler分类中的A类、B类和D类。KPC是一种在全世界范围内广泛传播的A类酶,目前在肠杆菌、假单胞菌和不动杆菌中都有发现,其中以肺炎克雷伯菌最为常见。本研究旨在探讨我国临床分离的产KPC酶的多药耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制,对其含有的耐药质粒进行表型和基因结构研究。第一章对临床收集到的两株产KPC多药耐药肺炎克雷伯菌0716和12181进行了深入研究。通过16S rDNA和肺炎克雷伯菌标示基因khe进一步核实鉴定细菌种属,利用改良Carba NP法检测碳青霉烯酶及其类型,PCR筛查碳青霉烯基因;通过接合转移或电转化得到产KPC的接合子或转化子;利用二代DNA测序技术对质粒全序进行测定,并对得到的质粒进行精细分析。结果显示,0716和12181均为产KPC的肺炎克雷伯菌,并得到接合子0716-KPC-EC600和电转化子12181-KPC-TOP10。二代测序分别得到两个携带bla_(KPC-2)的质粒p0716-KPC和p12181-KPC。经分析发现p0716-KPC和p12181-KPC的基因结构很相似。它们的骨架区都含有两个不同的复制子,并含有来自IncFIIK和IncFIIY的质粒稳定性区域,以及来自Inc FIIK的接合转移相关区域。p0716-KPC和p12181-KPC含有三个相似的耐药基因插入区,分别为ΔTn6209、多药耐药区和bla_(KPC-2)区,耐药基因bla_(KPC-2)、mph(A)、strAB、aacC2、qacEΔ1、sul1、sul2和dfrA25都位于这些耐药基因插入区。另外p0716-KPC还另含有两个耐药基因aphA1a和bla_(TEM-1)。结果表明,p0716-KPC和p12181-KPC都属于新的IncFII亚型,呈现嵌合体结构,携带多种耐药基因。第二章对来自连云港某医院的产KPC多药耐药肺炎克雷伯菌675920进行深入研究,共得到两个多药耐药质粒p675920-1和p675920-2。分析结果显示这两个质粒均为嵌合体结构质粒。p675920-1是由IncFII质粒pHN7A8和IncR质粒pKPC-LK30杂合构成的嵌合体结构质粒,但在p675920-1的复制起始区,IncR复制子突变为假基因,不能正常表达,所以p675920-1为仅Inc FII复制子发挥功能的质粒。p675920-2的骨架区呈现出一种马赛克结构,主要由自身独有的复制起始区及来自pKPYL2的质粒稳定维持区、来自pP10164-3的质粒稳定维持区、来自pK1HV的质粒稳定维持区和来自pKPYL2的接合转移区组成。p675920-1和p675920-2携带大量的耐药基因,介导对至少7类抗生素分耐药,包括β内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、磷霉素类、磺胺类、甲氧苄啶类和四环素类。这些耐药基因和插入序列、转座子等移动元件共同组成三个结构较新的多药耐药区,其中两个位于p675920-1,另一个位于p675920-2。p675920-1和p675920-2共存导致肺炎克雷伯菌675920趋向于泛耐药。第三章对2012-2016年间从我国五家医院收集到的51株产KPC的肺炎克雷伯菌中携带bla_(KPC)的质粒类型进行调查研究。选择菌株1068、20049、12139和64917进行深入研究并得到其携带bla_(KPC)的质粒全序。分析结果显示,测序得到的四个质粒均为与p675920-1及pCT-KPC类似的嵌合体结构。这六个质粒彼此间仅存在一些由于骨架区和外源插入区的插入或缺失导致的差异。这些质粒都包含两个主要的外源插入耐药区,分别为携带bla_(KPC-2)和bla_(SHV-12)的bla_(KPC-2)区及携带rmtB、fosA3、bla_(TEM-1B)和bla_(CTX-M-65)的多药耐药区,但六个质粒中这两个耐药区分别呈现出不同的进化路径。对pHN7A8/pKPC-LK30嵌合体质粒在产KPC酶的肺炎克雷伯菌中的流行情况进行调查显示,51株菌均包含此类质粒。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析显示,51株肺炎克雷伯菌均属于CG258。因此包含携带耐药基因bla_(KPC-2)和rmtB的pHN7A8/pKPC-LK30嵌合体结构质粒的肺炎克雷伯菌CG258克隆群菌株在我国的多家医院均为克隆化传播。综上所述,本研究中携带bla_(KPC)的质粒均为IncFII型别的嵌合体结构质粒,且均携带大量的耐药基因。质粒上各种抗菌药物抗性基因的积累是由于在多种抗菌药物的选择压力下各种复杂的移动元件水平转移事件导致的。细菌一旦获得这些多药耐药质粒就对多种抗菌药物产生抗性,并导致临床治疗中可选择的抗生素大大减少,最终引起死亡率上升。


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