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利用单细胞转录组学技术解析化生细胞起源和胃癌异质性

章敏  
【摘要】:胃腺癌是最常见的胃癌类型,90%以上的胃癌病例为胃腺癌。胃癌的病理特征受多种遗传和环境因素影响,胃腺癌也因此呈现出高度的形态学和分子异质性,而这种异质性阻碍了胃癌的精确诊断,对胃癌的临床治疗,全程管理,预后评估带来了一系列挑战。随着高通量测序技术的发展和肿瘤生物学现象的深入解析,从分子水平去解析胃癌异质性变得尤为重要。常规肿瘤块(bulk)测序由于检测的是基因的平均表达水平,掩盖了不同细胞群的特征,也因此无法分析组织内里的细胞多样性和细胞转录组状态异质性。另外,用已知抗体标记并纯化特定细胞群体的研究,无法涵盖所有细胞群体,并且无法检测稀有细胞群体或具有特定表型状态的细胞群体。因此,对于胃癌的异质性解析,迫切需要对胃癌前和恶性黏膜中单个细胞的表达进行全面而系统的分析。单细胞测序技术和微流控芯片技术的快速发展和联合应用使得研究者可以在单细胞分辨率下无偏颇,系统性的解析组织内的细胞组分和单个细胞的转录组特征。本研究拟采用这一高通量,高分辨率的转录组测序技术对胃正常组织,慢性胃炎胃黏膜组织和不同亚型胃癌黏膜组织进行全面且系统的细胞和分子普查,以探索胃癌癌前化生细胞的起源和解析胃癌异质性。本研究纳入了3例非恶性胃黏膜(1例胃炎黏膜和2例胃正常黏膜),9例原发性胃腺癌的黏膜活检样本组织。将胃黏膜组织分成两等份,一部分经过解离消化成单细胞悬液用于分选活细胞进行单细胞测序,而另一部分则用于其他实验,包括EBER检测和免疫荧光检查。经过严格的数据质控,得到了超过27,677个单细胞的转录组图谱数据。对这27,677个单细胞的转录组表达矩阵进行归一化处理,主成分降维分析,并选取前10个主成分进行t SNE降维和可视化。与此同时,通过对TCGA胃癌癌组织和正常组织的表达矩阵分析,筛选胃癌的特征性基因,并依据这些基因进行胃上皮细胞良恶性的迭代判别分析。在对胃上皮良恶性进行鉴别后,我们分析了非恶性胃上皮的细胞组成和分子特征,我们发现了6种胃上皮类型:主细胞,壁细胞,肠内分泌细胞,化生细胞,颈细胞以及表皮坑细胞,且壁细胞在炎症黏膜和胃癌组织黏膜中基本上没有被检测到。通过对胃黏膜主细胞,化生细胞和颈细胞的基因表达特征分析,我们发现来自于胃炎和肿瘤胃黏膜组织的胃黏膜主细胞在发育层级上与颈细胞,胃化生细胞之间有密切关联,假时间轨迹分析表明胃黏膜主细胞可以分化为颈细胞进而转变为化生细胞。这一基因表达特征的动态变化过程也在多色荧光染色结果中得到证实,我们的转录组发现验证了胃炎化生细胞起源于主细胞的转分化这一观点。基于单细胞转录组,我们提供了胃化生细胞起源的分子证据,这将有利于胃癌癌前病变的理解。已知胃癌是一种高度异质性的疾病,其组织病理学特征不同,分子特征也各异。我们对胃恶性上皮细胞进行了重新降维,聚类分析,得到了5个不同的群组(C1-C5),我们发现这些细胞群组是胃癌组织学类型或者病人特异性,表明高度的肿瘤间异质性。其中,胃型样本(C1)高表达胃特征性基因CLDN18,但KRT20,PHGR1,MUC13等分化相关的基因表达水平很低,肠型样本(C2)低表达CLDN18转录本,但分化相关基因表达水平不一。混合型样本(C3)没有很特异的特征基因,而是共表达胃型和肠型样本相关基因。有意思的是,我们发现两个肠型样本里呈现两种不同的分化层级峰值,这提示在同一个个体里,胃恶性细胞具有高度肿瘤内异质性。我们对这些恶性细胞进行分化程度的打分,我们发现胃型样本呈现低分化,肠型样本分化各异的现象。并且,依据选择的分化相关基因,我们对胃癌TCGA样本进行分化、分度层级打分,发现分化程度与胃癌的预后高度相关,高分化的胃癌组别有好的预后,而低分化的病患组别预后较差,两组数据其统计学意义显著。我们还发现两个区别于传统Lauren型的组别,其中,C4组别的细胞高表达胃黏膜主细胞标志物(例如LIPF和PGC),并且与Wnt/β-catenin信号通路相关。我们发现该类型胃癌与文献报道的主细胞主导型胃癌(GA-FG-CCP)一致,我们进而在两个公共批量转录组数据集中证实了GA-FG-CCP类型的存在。我们发现该类型胃癌涵盖了不同分期,并且是在亚洲人群和欧美人群中同时存在的一种新型胃癌类型。另一亚组的细胞绝大多数来源于一例EBV感染阳性的患者,除常规表达了上皮特异性基因如KRT18,Ep CAM,这些细胞也特异性表达了与免疫相关的签名基因(例如LY6K和MHC-II),并且该类型细胞的特征性基因富集了免疫抗原呈递和加工的相关Go term,这提示了EBV阳性胃癌的肿瘤微环境受到病毒感染后激活。考虑到MHC-II分子是肿瘤免疫治疗的相关靶标,我们的单细胞转录组数据可能揭示了EBV阳性胃癌患者受益于免疫治疗的原因。总之,我们从9份原发性胃腺癌样品和3份非恶性胃粘膜样品中构建了27,677个细胞的完整单细胞转录组图谱。着眼于上皮细胞,我们鉴定出了一组用于区分良性和恶性上皮的生物标志物。我们发现胃化生细胞来自于胃黏膜主细胞的转分化,转录组数据揭示的胃黏膜主细胞转变的结果应有助于阐明胃癌发生的机制。我们还描绘了肿瘤内部和肿瘤之间的不同分化程度,并预测了低分化程度患者的不良预后。此外,我们使用单细胞转录组数据和bulk转录组数据集确定了GA-FG-CCP和EBV+胃癌。由于这是一项初步研究,因此我们分析的局限性在于参与该研究的患者病例数量很少,我们的发现需要在更大的患者队列中进行验证。然而,尽管如此,以单细胞转录组谱为特征的GA分子谱分析可能为剖析肿瘤异质性铺平了道路,对临床实践具有重要意义。


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