参附配伍在心力衰竭大鼠体内的药代动力学研究

【摘要】：背景:附子(Aconiti Lateralis Radix Praeparata)为毛茛科乌头属植物乌头子根的加工品,有回阳救逆等功效,对心血管疾病有高效的治疗作用,同时,附子表现出较明显的神经毒性和心脏毒性,使用不当,会造成心律失常、昏迷,甚至死亡。附子中的主要毒效成分为双酯型和单酯型生物碱,由于治疗窗较窄,临床多数不良反应是由剂量使用不当引起的,所以多种剂量下附子的体内代谢物质基础值得深究。心力衰竭是各种心脏疾病发展的终末阶段,其发病率与死亡率极高,主要表现为呼吸困难和乏力,但目前尚无非常有效的治疗方案,而附子与红参合用能够用于改善体内的血液循环,临床上常用参附配伍来治疗心力衰竭等疾病,然而,附子与红参合用在心力衰竭动物体内的代谢动力学特征是不明确的,因此,需要进一步探究附子和红参合用在病理状态下的代谢特征,从而更好为附子的临床安全应用提供依据。目的:建立一种专属性强、灵敏度高、快捷方便的大鼠血浆样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、苯甲酰新乌头碱的UPLC-MS/MS联用的定量分析测定方法,并进行方法学的验证;测定分析单次灌胃给予正常大鼠0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg附子后的药代动力学参数的变化规律,比较各组间的药代动力学参数;建立并评价心力衰竭大鼠模型,测定分析附子在正常大鼠和心力衰竭大鼠体内代谢动力学的差异,并在模型的基础上,测定连续给药红参对附子代谢行为的影响。方法:采用蛋白沉淀法对生物样品进行预处理,建立大鼠血浆中六种物质的UPLC-MS/MS定量测定分析方法,以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相,进行梯度洗脱分离,采用多反应监测的正离子模式进行定量检测,对方法的专属性、灵敏度、精密度与准确度、基质效应与提取回收率以及稳定性按照2020版《中国药典》的要求进行验证。不同剂量附子的药代动力学研究方法:将24只SD大鼠,雌雄各半,随机分为三组,分别给予低(0.5 g/kg)、中(1.0 g/kg)、和高(2.0 g/kg)三个剂量的附子,并于给药前和给药后0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24和48 h,从眼底静脉丛采集0.30 m L的血样,经过样品的前处理,利用UPLC-MS/MS进行定量检测,采集的数据经过Excel、Graph Pad软件和SPSS软件进行分析、处理,药代动力学参数的计算利用DAS药动学程序软件,采用非房室法进行分析。通过结扎大鼠的左冠状动脉降支,造成心肌缺血,建立心力衰竭的动物模型,主要从大鼠血清中BNP、CTNT、AST、CK、CKMB等心衰标志物的含量变化,大鼠的心电图、颈动脉压、左心室内压,以及心脏系数和相应的病理切片来评价心力衰竭动物模型的建立是否成功。参附配伍后附子在正常大鼠及心力衰竭模型大鼠体内药代动力学研究方法:将实验用鼠分为三组,每组8只,正常组、模型组、红参组,红参组为心肌梗死模型大鼠恢复2周后,连续7天灌胃给予1.0 g/kg红参提取液,每天1次,其他两组同时给予蒸馏水1.0 m L/kg。模型建立三周后各组大鼠口服给药1.0 g/kg附子,并于给药前、给药后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24和48 h,从眼底静脉丛取0.30m L的血浆样本,经过样品的前处理,采用UPLC-MS/MS联用的方法检测,并利用Excel、Graph Pad、SPSS软件对采集的数据分析、处理,利用DAS软件采用非房室法进行计算分析药代动力学参数。结果:建立了同时测定大鼠血浆中六种乌头类生物碱浓度的方法,该方法的标准曲线的范围为0.1～10 ng·m L~(-1),能够5 min内检测六种乌头类生物碱的血药浓度,在专属性、线性、准确度与精密度、稳定性、提取回收率和基质效应等方面均符合2020版中国药典中的生物分析方法验证指南。不同剂量的附子在正常大鼠体内代谢的主要药代动力学参数表明,低剂量组六种物质的AUC_((0-48h))为13.47±3.28,62.90±26.89,26.39±5.42,16.21±5.43,0和6.85±2.40μg/L*h,而高剂量组则为23.82±7.77,185.72±64.72,85.82±20.71,50.54±19.45,17.29±6.18和44.20±18.82μg/L*h,可以看出,高剂量组的AUC_((0-48h))显著高于低剂量组,表明吸收更好;六种乌头类生物碱在高剂量组的V_z/F为166.81±80.09,80.41±35.49,87.22±43.08,800.57±396.01,383.54±177.00,616.61±290.20 L/kg,而低剂量组为14.01±4.33,12.75±6.88,33.10±25.06,193.64±116.81,0,207.34±75.96 L/kg,由此可以看出,高剂量组的六种乌头类生物碱能够分布到更广泛的组织器官中;高剂量组中六种物质的t_(1/2)为11.47±4.30,11.92±4.59,6.04±3.85,13.67±4.26,8.75±7.14和19.14±8.84 h,而低剂量组分别为1.90±0.31、1.83±0.64、1.72±0.25、4.48±0.64、0和4.53±3.84 h,说明高剂量组的药物作用时间更加持久。通过结扎左冠状动脉降支得到了心力衰竭模型大鼠,手术过程中发现使用呼吸机、电热毯以及下移结扎部位可以明显提高大鼠的存活率;评价模型的结果显示,正常组和假手术组各项指标均无统计学差异;相比与正常组,模型组大鼠血清中心衰标志物BNP、CTNT、CK、AST、CKMB的水平均有显著升高;模型组大鼠的心电图出现ST段升高的现象,并且模型组大鼠的LVSP、+dp/dtmax出现显著下降,而LVEDP、-dp/dtmax则出现明显的上升趋势,但是HR、MAP无统计学差异;从心脏的状态看,观察到模型组大鼠的心脏系数明显升高,出现明显的心肌肥厚,心肌组织梗死的现象,并且模型组大鼠的心脏病理切片显示心肌细胞有大面积死亡的现象,心肌纤维间隙增宽;相比于模型组,红参组大鼠体内的心力衰竭标志物显著降低,心电图、心功能指标显著改善,心肌组织细胞的死亡区域较小,心肌细胞的纤维间隙有所缩窄。附子在正常和心力衰竭大鼠体内的代谢动力学结果表明,由药代动力学参数可知,模型组的AC、HA的T_(max)依次为2.25±1.73,2.00±1.64 h,正常组则为4.57±1.51,5.33±3.27 h,红参组为5.14±1.95,5.33±2.07 h,模型组AC、HA的AUC_((0-48h))为3.96±1.47,54.58±19.35μg/L*h,正常组为8.25±3.51,138.42±33.39μg/L*h,红参组为8.29±3.10,151.11±59.46μg/L*h,可以看出,与正常组相比,模型组大鼠T_(max)明显缩短,AUC_((0-48h))显著降低,而红参组的T_(max)则延长,AUC_((0-48h))增加;表明模型组大鼠对附子中两种乌头碱的吸收相对较低,且短时间内便能达到峰值;连续给药红参后,附子中两种乌头碱的吸收值明显升高,达到了促进其吸收的功效,且峰浓度有降低的趋势;三组间的V_z/F无显著性差异,表明在心衰状态下这两种生物碱的分布和正常大鼠体内的分布相近;模型组中AC、HA的t_(1/2)分别为4.48±1.72,4.17±0.34 h,正常组为10.99±4.25,9.16±3.30 h,红参组为17.83±8.78,7.63±0.78 h,可以看出,与模型组相比,正常组和红参组中AC、HA的t_(1/2)明显延长;模型组中AC、HA的体内Cl_z/F为23.08±6.46,7.59±2.29 L/h/kg,正常组为13.20±3.27,3.26±0.74 L/h/kg,红参组为9.01±3.11,3.49±1.26 L/h/kg,可以发现AC、HA在模型组大鼠的体内Cl_z/F显著升高,说明模型组大鼠对药物的消除速率更快,时间更短。结论:建立了一种同时测定大鼠血浆中六种乌头类生物碱浓度的UPLC-MS/MS联用方法,该方法具有快捷、灵敏、专属性强、重现性好的特点,可用于附子主要成分的代谢动力学研究;附子中六种乌头类生物碱的多剂量药代动力学参数提示,六种化合物的峰浓度、t_(1/2)和AUC_((0-48h))均随剂量的增加而增加,六种乌头类生物碱在大鼠体内的代谢动力学特征在高、低剂量组之间存有显著差异,高剂量组的六种乌头类生物碱表现出吸收更快,消除更慢,分布更广的特征;通过结扎大鼠心脏左冠状动脉降支,建立的心力衰竭大鼠模型满足要求,同时也表明红参对心衰大鼠的心功能有一定的改善;最后,相比于正常大鼠,附子提取液在心力衰竭模型大鼠的体内吸收较差,代谢速率加快,当连续给予红参后,附子在模型大鼠体内下的吸收是有所增加的,消除速率减缓,进一步说明了红参与附子配伍增效减毒的体内物质代谢动力学基础,这些药代动力学的数据能够为附子的临床安全应用提供有价值的依据。