收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

水动力转染技术在IFNβ-Luc小鼠模型与HBV树鼩模型研究中的应用

周勇  
【摘要】:水动力转染方法是一种简单、有效的将外源物质转染至活体动物细胞中的非病毒转染方法,这种方法是利用快速大量将溶液注射进血管,迅速产生压力增加血管内皮和细胞膜的通透性,将携带的物质转入细胞内。水动力转染方法越来越多的用在活体动物的研究上,包括动物模型建立、疾病的治疗、基因免疫等、药物评价等。该方法可用来将质粒DNA、基因组DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质等目的分子转染到活体动物的组织器官中。利用水动力转染的平台,本研究探索了两种实验动物模型,一种是用于与病毒感染密切相关的天然免疫分子IFN-β活性监测的小鼠模型,另一种是乙型肝炎病毒质粒转染的树鼩模型。以期在这两种模型的基础上进一步的研究肝炎病毒感染及免疫致病机制。 第一部分水动力转染方法建立IFN-β启动子调控荧光素酶表达小鼠模型 I型干扰素(Interferon ,IFN)在天然免疫反应中有着重要作用,其主要成员是IFN-α和IFN-β,干扰素最先被人们发现是因为它的抗病毒的作用,后来的研究发现它还参与器官发生、肿瘤的发展等生理病理学的机制。病毒的识别及蛋白信号级联反应的启动是引发抗病毒天然免疫的必要条件,病毒感染或是双链RNA、双链DNA都能够诱导I型干扰素的产生,随后I型干扰素通过自分泌或者旁分泌结合到细胞表面引发干扰素级联反应,通过正反馈诱发干扰素刺激基因ISGs的大量表达,这些基因编码一系列的抗病毒蛋白和炎性因子来阻止病毒的扩散避免宿主进一步的被感染。但是许多病毒在进化过程中逐渐产生一些逃避免疫的方式。一些细胞水平上有关干扰素的调节机制的研究丰富了天然免疫网络。但是在有着完整免疫力的活体动物内进行的研究相对较少。肝脏是蛋白合成和许多天然免疫成分活化的一个重要场所,许多免疫相关分子能够被肝细胞来源的信号活化,肝脏作为一个重要的免疫器官的说法在逐渐被人们接受。肝脏的天然免疫系统在肝炎病毒感染及其免疫致病中发挥何种效应,已经成为学者们研究的热点。 因此本研究构建了一种含有噬菌体整合酶识别位点attB的、由IFN-β启动子调控萤火虫荧光素酶表达的报告基因载体;先细胞水平通过荧光素酶检测和荧光成像来验证了该载体能够正常表达。然后通过水动力注射法将质粒转染至小鼠肝脏,并通过活体成像和Western blot证实了该质粒在小鼠肝脏的表达。进一步通过巢式PCR和活体荧光成像证实了表达载体在小鼠肝脏发生位点特异性整合。上述结果提示已成功建立IFN-β启动子调控荧光素酶表达小鼠模型。随后我们用经典的IFN-β的激活剂poly(I:C)来诱导小鼠模型肝脏中的荧光素酶表达,荧光素酶在6-8小时达到峰值。同时用ELISA法监测血清中的IFN-β,血清中的IFN-β的表达在时效上与荧光素酶表达一致,结果显示报告基因的表达能够指示IFN-β的活化。用不同剂量的poly(I:C)来激活小鼠肝脏的IFN-β,结果显示激活小鼠肝脏IFN-β最佳剂量为250μg/kg。已知HCV NS3/4A蛋白酶能够在人的细胞中阻断IFN-β信号通路,我们将HCV NS3/4A质粒水动力转染到小鼠肝脏,通过活体成像、血清IFN-β监测及Western blot检测,结果提示HCV NS3/4A蛋白酶能够在小鼠体内阻断IFN-β信号活化通路。 以上结果显示,我们建立了一种灵敏、稳定的在活体肝脏内评价IFN-β活性的模型体系,用此模型动物可以研究不同因素在体内对IFN-β启动子活性的调节作用,也可作为天然免疫中干扰素调节药物的评价模型。同时也有助于体内研究肝脏的天然免疫系统和肝炎病毒之间的相互作用。 第二部分水动力转染方法初步建立HBV转染树鼩模型 乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害人类健康的嗜肝DNA病毒,全球约有1/4的人曾经感染过HBV,有约3.6亿慢性携带者。虽然大部分成年人在感染后病毒很快被清除,但婴幼儿感染HBV后却有很高的慢性化率。HBV慢性感染的机制至今未能明确,长期以来缺乏合适的动物模型阻碍了HBV的研究进展。HBV有严格的宿主特异性,已知的宿主有人,黑猩猩、和树鼩。黑猩猩等灵长类动物价格昂贵,实验还受到伦理学的限制。树鼩是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物,在生物进化上比啮齿类、猫、犬、兔等动物更接近灵长类。新陈代谢与解剖结构比啮齿类更接近人类,且易于驯养。因此,树鼩可能是应用于建立人类疾病动物模型的最佳动物之一。近年来在建立嗜肝病毒感染模型上有着较多的探索并取得了一定的进步。常规感染方法是用阳性血清或纯化的病毒颗粒接种树鼩,但是阳性率低,多为一过性感染。因此我们尝试用水动力转染HBV质粒的方法建立树鼩肝炎模型。 为了建立一种水动力注射将外源基因导入树鼩肝脏的方法,本研究摸索了水动力转染树鼩的适宜条件,确定了树鼩水动力注射以0.8ml/s速度注射100ml/kg的生理盐水为最佳条件。在确定了水动力转染的条件后用萤火虫荧光素酶和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)作为报告基因,通过树鼩大隐静脉将报告基因导入树鼩肝脏,通过活体成像和β-Gal染色观察到报告基因在肝脏特异性的表达,活体成像检测到肝脏中荧光光子数达到106~107。然后将pAAV/HBV1.2质粒用水动力转染的方法转入树鼩肝脏,检测到树鼩血清中ALT在注射后第1天达到峰值,3天后恢复到原来水平,实时荧光定量检测血清中HBV DNA在一周内一过性的升高,检测值在103~105,到第二周大部分树鼩血清HBV DNA降至检测线下。ELISA检测血清中HBsAg一过性升高,一周后大部分树鼩血清HBsAg转阴,部分树鼩在一周后出现anti-HBsAg。用环磷酰胺抑制树鼩免疫力后,水动力转染pAAV/HBV1.2质粒,血清标志物检测结果对照组和实验组未见有明显差别。水动力转染后树鼩血清标志物阳性率达到90%。由于树鼩不是模式化动物,树鼩之间个体差异大,所得数据差异也较大。 因此本研究结果显示大隐静脉水动力注射法能够作为外源基因导入树鼩肝脏的一种方法,用这种方法初步探索了树鼩的HBV转染模型。本研究可为建立树鼩感染肝炎病毒模型提供一种新的方法。 本研究以水动力转染技术作为平台,成功建立了IFN-β启动子调控荧光素酶表达小鼠模型,并用此技术初步探索了树鼩的HBV模型的建立。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张海林,米竹青,施华芳,自登云;树鼩实验感染基孔肯雅病毒的研究[J];病毒学报;1991年02期
2 苏建家,罗丹,黄定瑞,黄国华,杨春,严瑞琪;用原位杂交对树鼩肝组织乙型肝炎病毒DNA定位及其与黄曲霉毒素B_1在肝癌发生中的作用[J];肿瘤;1993年06期
3 叶峻;;树鼩伏隔核颅内定位[J];解剖学杂志;1993年02期
4 柴慧霞,谢扬高,陈启贤,黄云;合成新药SC1001胺盐对抗马桑内酯所致树鼩癫痫和镇静作用的研究[J];四川大学学报(医学版);1989年01期
5 苏建家,王憬惺,杨春,黄国华,班克臣,罗小玲,杨显福,严瑞琪;树鼩对人乙型肝炎病毒实验感染的量反应[J];胃肠病学和肝病学杂志;1995年03期
6 吕新跃,陈保生,王克勤;树鼩肝组织cDNA文库的快速构建[J];武警医学院学报;1998年01期
7 李文琦,周激文,李欣,周天禄,钟咏梅,李霞,苏兆虞;树鼩皮质醇测定的研究[J];放射免疫学杂志;1999年01期
8 冼苏,黄松,秦映芬,罗佐杰,韦敏怡,欧超,苏建家;链脲佐菌素诱导树鼩糖尿病动物模型研究[J];广西医科大学学报;2000年06期
9 陈保生,王克勤,王健美,佘铭鹏,卢耀增,夏人仪,吕寿和,赵三妹,刘佩毛,刘连生,安维明,冉碧芳,谷素敏,陶保卫;树鼩血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白物理化学性质的研究[J];基础医学与临床;1983年05期
10 归航,袁建刚,蔡良琬;臭鼩DNA高重复顺序的研究同树鼩的TSr(Bg1 ll)—1顺序比较[J];中国生物化学与分子生物学报;1987年05期
11 吴小闲,唐恩华,张新生,徐维明,谢广珍,文喻玲,刘名英,肖慧芳,涂新明,蒋虹,施慧君,曲丽荣;树鼩腺病毒(Ⅰ和Ⅱ型)的生物学性状、抗原关系和血清抗体的研究[J];中国医学科学院学报;1990年02期
12 吴一迁,于永梅,陈建泉,罗海涛,姚明,成国祥,钱耕荪;肌注前列腺素提高非繁殖期树鼩的受孕率[J];上海实验动物科学;2001年03期
13 李家立,李树清;树鼩血栓性脑缺血时单胺氧化酶(MAO)活性的变化及银杏内酯B作用机理的探讨(摘要)[J];昆明医学院学报;2000年04期
14 陶立新;“HBV和AFB_1与PHC发生关系在树鼩的实验研究”获奖[J];中国肿瘤;1994年01期
15 郭泽云,彭庆廉,刘汉武;加压素样神经元在树鼩、大鼠、豚鼠下丘脑室旁核的分布与比较[J];昆明医学院学报;1995年04期
16 谢志春,高伟志,苏洁寒,邬质彬,徐国城,Jose Ignacio,Riezu Boj,Jesus Prieto;树鼩对丙型肝炎病毒的易感性研究[J];广西医科大学学报;2000年03期
17 吴钢,陈保生;树鼩血清载脂蛋白A-I的分离纯化及其N端部分氨基酸残基序列的测定(简报)[J];中国医学科学院学报;1994年05期
18 闵峰!361000,郝飞,刘冰,刘国栋,宋志强,王宇明,宋闽宁!361000;丙型肝炎病毒体外感染成年树鼩肝细胞的初步研究[J];肝脏;2001年S1期
19 蔡良婉,黄秉仁,王丹平,阎珺;树鼩高重复顺序TSr(Bgl-Ⅱ)-1的核苷酸顺序分析及与灵长类α-顺序的比较[J];中国生物化学与分子生物学报;1986年02期
20 苏军达,刘世熠;树鼩下丘脑视交叉上核传入联系的研究[J];神经解剖学杂志;1995年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 曹筱梅;贲昆龙;谢云华;;促性腺激素诱导树鼩排卵[A];西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集[C];2000年
2 龚敏;;体外培养树鼩视网膜Mller细胞的实验研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
3 郭学军;邹移海;;升降散在建立流感病毒树鼩模型中的作用初探[A];首届中国中医药实验动物科技交流会论文汇编[C];2002年
4 郭小芳;蒙碧辉;陆丽莹;;罗格列酮对非酒精性脂肪肝病树鼩肝细胞PPARγ表达的影响[A];中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2011年
5 张川荛;李树清;;后适应对树鼩血栓性脑缺血时神经保护效应的比较研究[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
6 郭泽云;杨力;李素华;吴春云;战雅;;树鼩、大鼠、豚鼠正中隆起后叶加压素样神经纤维的分布[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
7 王茜;李树清;;后适应对树鼩脑缺血后心脏功能异常改善作用的研究[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
8 李海燕;黎家敏;李靖潇;王新兴;代解杰;;高糖高脂饲料联合地塞米松诱发树鼩血糖、血脂异常[A];第九届中国实验动物科学年会(2010新疆)论文集[C];2010年
9 李树清;李家立;杨丽君;;树鼩实验性瘀症时半暗区PAF受体与MAO活性改变的相互关系[A];第五次全国中西医结合血瘀证及活血化瘀研究学术大会论文汇编[C];2001年
10 李树清;陈静;张颖;李凡;;后适应改善树鼩缺血海马神经元微环境对线粒体应激的影响[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 何光耀;树鼩听觉中枢核团的初步研究[D];广西医科大学;2014年
2 蒙碧辉;糖尿病骨骼肌病变及其发病机制的实验和临床研究[D];重庆医科大学;2003年
3 周勇;水动力转染技术在IFNβ-Luc小鼠模型与HBV树鼩模型研究中的应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
4 阮萍;树鼩慢性感染乙肝病毒过程中肝组织病理学观察及枯否细胞变化意义的探讨[D];广西医科大学;2013年
5 汤諹;PI-3K/Akt信号转导在树鼩脑缺血及后适应中的作用机制研究[D];昆明医学院;2008年
6 张晶晶;树鼩、小鼠HBx、ras转基因模型及体外HBV感染模型的研究[D];广西医科大学;2008年
7 李飞;亚低温后适应对树鼩局灶性脑缺血VEGF表达及神经元抗凋亡机制的研究[D];昆明医学院;2010年
8 何文辉;乙型肝炎病毒感染模型的建立及其早期入侵的分子机制的研究[D];北京协和医学院;2013年
9 雷玉洁;转化生长因子β1、ica操纵子对肺癌患者生物材料细菌生物膜形成的影响[D];昆明医科大学;2012年
10 何波;缺血后适应对树鼩血栓性脑缺血磁共振成像及脑保护的分子机制研究[D];昆明医科大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李军;树鼩慢性乙型肝炎病毒感染模型的探索[D];第三军医大学;2013年
2 王新兴;野生树鼩病毒自然感染调查及普通级实验树鼩病毒监测指标的研究[D];北京协和医学院;2011年
3 王琦;新生期树鼩感染人乙型肝炎病毒模型的优化[D];广西医科大学;2010年
4 王佳;树鼩体内感染丙型肝炎病毒的实验研究[D];广西医科大学;2012年
5 王东坤;树鼩肺癌模型与生物材料植入感染关系的初步研究[D];昆明医学院;2010年
6 薛梅;丙型肝炎病毒对树鼩原代肝细胞感染性的研究[D];昆明理工大学;2010年
7 杨晓燕;骨髓间充质干细胞移植治疗树鼩糖尿病肾病的研究[D];昆明医科大学;2013年
8 曾兴光;乙肝病毒体内外感染模型的建立及其在乙肝新药药效学评价中的应用[D];第三军医大学;2010年
9 哈迪;糖尿病树鼩早期肝损害中TGF-β_1的意义[D];广西医科大学;2001年
10 贺猛;3-甲基胆蒽与二乙基亚硝胺对树鼩支气管上皮影响的研究[D];昆明医学院;2011年
中国重要报纸全文数据库 前5条
1 记者 黄才刚;树鼯是乙肝研究理想动物模型[N];健康报;2000年
2 张刚强;生物医学和药物研究动物模型规划研讨会召开[N];中国医药报;2010年
3 本报记者 马波;探秘“猴别墅”[N];科技日报;2011年
4 本报记者 白毅;国家级灵长类研究中心亟待建立[N];中国医药报;2011年
5 记者 熊燕;多层次科研平台提升新药研发创新能力[N];云南日报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978