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狂犬病病毒BD06株生物学特性鉴定及反向遗传系统的建立

潘铁骊  
【摘要】:狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种可以感染所有温血动物的人兽共患病。每年在全世界范围内大约有55000人因感染狂犬病而死亡,其中56%来自于亚洲,44%来源于非洲;在亚洲、非洲,狂犬病已经成为一个重要的公共卫生学问题。在发展中国家,人的狂犬病主要由犬的狂犬病造成。在中国,尽管采取了相应的防治政策,但是犬的狂犬病尤其在农村地区,始终没有能够得到有效的免疫覆盖,因此狂犬病仍是一个我国现行动物疫病控制工作中需要解决的问题。 针对我国狂犬病流行现状,本研究对我国狂犬病高发地区进行了动物狂犬病分子流行病学调查,对我国现有流行毒株的遗传本底进行了有效揭示,对所有鉴定阳性的毒株进行了分离及生物学鉴定,以其中一株具有代表性的街毒株BD06为研究对象,对病毒理化特性、生物学特性、遗传稳定性进行了系统研究,在此基础上构建了首个以街毒株为对象的反向遗传操作系统,为了解我国狂犬病街毒株致病机制、狂犬病疫苗的开发研究奠定了基础。主要结果如下: 1.我国狂犬病高发地区狂犬病毒流行毒株分子流行病学调查 本研究对我国狂犬病高发地区(7个省份)进行了狂犬病流行毒株的分子流行病学调查,通过DFA、RT-PCR、乳鼠分离等方法鉴定、分离出18株街毒株,分别对其N、G基因的完整开放阅读框序列进行了PCR扩增,获得N、G基因序列各18条,选取了常用疫苗株及不同地理分布、来源宿主的流行毒株作为参考,分别进行了基于N、G基因的系统进化分析,结果显示:18株街毒株均属于RABV,可分为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ3个群,其G基因系统进化分析可分为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ3个群,N基因分群结果与G基因分群结果一致。地理来源与遗传进化分析结果显示:河北省毒株之间亲缘关系较近,其它6个省份的毒株来源较为复杂。明确了我国狂犬病街毒株BD06株的遗传进化地位,其处于我国流行毒株分布最广的一群中,其N基因与我国其它流行毒株同源性为86.3%~99.7%,G基因与我国其它流行毒株同源性为96.2%~99.6%,均高于标准攻击毒CVS与我国流行毒株的同源性,其G基因与抗原性、毒力相关的重要位点及糖基化位点保守,未见变异。 2.我国狂犬病病毒街毒株BD06株的生物学特性研究 以我国狂犬病流行街毒株BD06株为研究对象,对该株病毒的理化特性、对小鼠、犬的致病性、病毒适应细胞系的筛选及适应性传代、该株病毒在细胞、小鼠体内的动力增殖生长曲线测定、及该株病毒连续传代后的遗传稳定性进行了研究。 结果表明,该株病毒对温度、常见有机溶剂、紫外线、弱酸、强碱均敏感;100℃作用10s,56℃作用2min,紫外线照射2min,在pH5以下的酸性环境和pH11以上的碱性环境、75%乙醇作用2min、氯仿作用5min、30%以上丙酮、0.05%甲醛下室温作用6h、10%福尔马林作用20min可使病毒灭活。该毒株对胰酶不敏感。该毒株可使小鼠100%死亡,以105小鼠LD50接种犬后,潜伏期为9~14天,病程约2天,可导致80%以上受试犬发病死亡;其细胞培养滴度在70代后可以达到107.5TCID50/ml,在细胞水平传至80代,其N基因仅有1个碱基发生突变,G基因有4处发生变化并引起氨基酸变化,其中365、496位碱基突变为两种细胞系共有变化。增殖动力学数据表明,细胞培养水平采用DFA方法最早可以在24小时检测到病毒抗原,在96小时达到高峰;鼠脑内采用免疫组化的方法最早可以在156小时检测到病毒抗原。 3.我国狂犬病病毒街毒株BD06株反向遗传操作系统的构建 以BD06株为研究对象,对其测序获得全基因组序列,并对各个功能基因进行序列分析,获知分子生物学信息。设计9对引物对其全基因组进行分段扩增,克隆于改造的质粒载体后,获得了带有锤头状核酶、丁型肝炎核酶、伪基因处插入了Linker的全长cDNA重组质粒pcDNA3.1-BD;构建了含有BD06核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、糖蛋白(G)、RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)的4个辅助表达质粒,分别命名为pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G、pcDNA3.1-L。将这5个质粒共转染BHK-21细胞。结果表明:转染后的细胞经DFA、RT-PCR鉴定后,证明成功拯救出重组病毒,初步构建了狂犬病街毒株的反向遗传操作系统。


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