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抗流感药物宿主靶标筛选及验证

赵海豹  
【摘要】:病毒性流感是由流感病毒(Influenza viruses,IV)引起的世界性传染疾病,它可以引起不同程度的疾病症状,从较轻微没有明显症状到呼吸系统失调和心、脑、肝、肾等其他脏器受损,并引起细菌的二次继发感染等都有发生,严重威胁到人类的健康。动物源性的高致病性、高致死率的禽流感病毒(H5N1)、猪流感(H1N1)已经导致了世界上数百上万人的死亡,给当今世界造成了巨大的经济损失、劳动力损失和心理恐慌,并对人类健康威胁日益严重。 然而现有的治疗手段疫苗和针对流感病毒的药物等具有一定的局限性,不能完全应对流感病毒感染的威胁,需要新的治疗策略。新的生物技术能够特异性抑制病毒基因组的复制表达从而达到抗病毒的目的,但是病毒基因组结构简单、易变异、可以利用的靶点少,存在一定的不足[1,2]。 流感病毒能引发一系列宿主细胞内的信号事件和复杂的细胞反应[3,4]。通过了解病原微生物和宿主间的相互作用,有助于探寻病毒感染致病相关的宿主分子,而且现有证据表明,宿主蛋白对流感病毒在宿主细胞中的复制具有重要作用,是潜在的抗病毒新靶标。通过靶向这些分子靶标进行特异性调节,可以抑制病毒在宿主体内的繁殖和致病。并且针对这些靶标可以进行病毒感染的机理性研究,从而为开发常规及新的抗病毒药物的设计提供理论支持,实验室和临床中的研究结果已经证实这种新的抗微生物策略的有效性,这也是新的抗病毒策略研究方向。 蛋白质组学(Proteomics)是指从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态,了解蛋白质之间相互作用和联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一门科学[5]。利用蛋白质组学技术可以较全面地了解病毒和宿主细胞之间的相互作用引起的功能蛋白变化的情况。而亚细胞蛋白质组学研究更是提供了一种研究细胞器间差异表达蛋白质的方法。 反义药物与特定基因杂交,进而在基因水平干扰蛋白的合成,是以比传统药物更具有特异性和高效性,已成为新型治疗药物研制的热点。由于反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide,ASODN)的作用靶点位于胞内,而其本身是阴离子多聚体,相对分子质量大、极性强、电负性强,这些特征使其难以透过细胞膜的脂类双分子层进入细胞,故反义药物细胞摄取率低。甚至有报道称仅有1%~2%的反义药物被细胞摄取[6],所以提高细胞摄取率是反义药物研发过程中的一大挑战。目前提高反义药物细胞摄取量的方法主要有偶联多聚阳离子、与阳离子脂质体形成反义寡核苷酸脂质体复合物、偶联跨膜肽等[7,8]。这些物质能有效地提高反义药物的细胞摄取量,但由于它们潜在的细胞毒性使其临床应用受到了一定的限制,因此亟待寻找更加合适的ASODN靶向修饰分子,提高反义寡核苷酸类化合物的胞内摄取与药效,来增加反义核酸抗流感的成药性,因此对筛选出来的抑制流感病毒所致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)效果最好的序列进行了优化,使其具有最佳的活性和长度,并且选择了金刚乙胺和脂肪链作为修饰物,设计了修饰合成的路线,以期将反义药物效果进一步提高。 因此本研究采用亚细胞蛋白质组学技术,旨在以双向电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)为基础,结合质谱(mass spectrum,MS)的方法寻找流感病毒引起的宿主差异表达或在细胞器之间转移的蛋白质分子,并结合文献报道及生物信息学方法,寻找病毒感染致病所必需的宿主因子,来探讨流感病毒感染致病的分子机理,进而研究开发相关的抗病毒措施,开发抗病毒药物。 本研究中包含以下内容: 1.病毒感染相关宿主蛋白质的筛选 在本研究中,从病毒感染和对照组的肺癌细胞(A549)细胞核、细胞质和线粒体中抽提出的蛋白质。共发现112个差异表达的蛋白质分子点,从核,细胞质和线粒体蛋白样品中分别发现40,52和20个差异蛋白质点,其中30,37和13个蛋白质点分别被成功鉴定,这些蛋白可能成为抗病毒设计的宿主靶标。结合文献报道及生物信息学,也分别选定了31个及3个病毒感染相关蛋白质。 2.病毒感染相关宿主蛋白质差异表达特异性验证 对质谱法所鉴定出的蛋白ISG15,MIF,PDCD5和UCHL1的差异表达用蛋白免疫印记法(Western Blot,WB)方法进行了验证。证明了这些蛋白质在宿主细胞中的差异表达是由病毒感染引起。 3. ASODNs的设计、合成及抗流感效果验证 计算机软件设计合成了靶向ISG15,MIF,PDCD5和UCHL1以及文献报道和生物信息学方法筛选出病毒感染相关宿主蛋白质的ASODNs,并用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)和细胞活性实验验证了这些ASODNs对病毒感染的影响,结果显示:靶向ISG15,MIF,PDCD5和UCHL1的ASODNs,能显著抑制IV的复制和IV引起的细胞病变效应。其中抑制作用作用最为显著的是对PDCD5蛋白mRNA的抑制。继而在H1N1、H3N2及H3N2金刚乙胺耐药病毒株等不同亚型和不同毒株上进行进一步的实验,结果表明抑制PDCD5后能够广谱的抑制不同亚型和毒株流感病毒致细胞CPE的作用。说明PDCD5在流感病毒诱导细胞死亡的过程中有着至关重要的作用,是潜在抗流感病毒治疗靶标。 4.反义核酸序列的长度优化 通过改变反义核酸序列的长度,在细胞上进行抗病毒活性的检测,选择最优的反义核酸序列,使设计合成的反义核酸兼有最佳的抗流感活性、最低的合成难度以及最低的用药量等优点,经过筛选得到具有最佳抗流感活性的反义序列为20个碱基长度的靶向PDCD5蛋白mRNA的5号序列。 5.高表达PDCD5蛋白对流感病毒感染的促进作用 抑制PDCD5蛋白的表达可以抑制流感病毒所致细胞病变,所以实验用促进蛋白表达方法对实验结果进行了验证,在实验中构建了PDCD5的原核及真核质粒,用质粒转染宿主细胞和向培养液中添加蛋白的方法验证了高表达PDCD5蛋白对病毒感染的作用。实验结果表明,PDCD5蛋白的高表达的确促进了病毒对宿主细胞的感染,强化了PDCD5是潜在抗病毒宿主靶标的可能性。 6. ASODN体内抗流感病毒效果验证 为了在动物模型中验证前述的实验结果,建立了H1N1型高致病性猪流感病毒感染的小鼠模型。通过滴鼻的途径给予小鼠不同浓度的靶向PDCD5的ASODN,给药后发现小鼠的存活率、存活天数和体重下降均得到了改善,对小鼠的肺指数和肺脏病毒滴度也有不同程度的改善作用。以上工作显示PDCD5差异表达及由细胞质向细胞核富集在流感病毒感染和致病过程中具有非常重要的作用,靶向PDCD5的反义核酸可能成为治疗流感的药物。 7.金刚乙胺或(和)脂肪链修饰ASODNs序列的设计、合成及抗流感效果验证 目前,金刚乙胺是一种的抗流感病毒药物,但流感病毒的抗原漂移导致病毒对金刚乙胺产生了一定的耐药性。为了克服ASODN药物的细胞摄取率低及流感病毒对金刚乙胺的耐药性,在本研究中把金刚乙胺或者脂肪链偶联到ASODN分子上,以期能够借助金刚乙胺或脂肪链的透膜性提高ASODN在细胞中的摄取量,提高其治疗流感的效用。实验结果表明,脂肪链或(和)金刚乙胺的修饰提高了反义序列的抗流感活性,降低了反义序列抑制流感病毒所致细胞病变的IC50。用荧光标记的反义核酸序列证明了,金刚乙胺的修饰的确提高了反义序列进入细胞的量.。 综上所述,研究中所发现病毒感染引起差异表达的宿主蛋白质可能为理解流感病毒和宿主相互作用提供更好的的线索;PDCD5在流感病毒感染导致细胞凋亡的过程中具有重要的作用;在细胞和动物模型上的实验表明PDCD5是一个潜在的抗流感病毒感染致病的宿主靶标,靶向PDCD5蛋白mRNA的反义核酸序列为抗流感的候选ASODN序列;找到了两个提高细胞对ASODN摄取率的可行办法。


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