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辐射对肺腺癌细胞侵袭能力的影响及其分子机制研究

李峰生  
【摘要】:放疗是恶性肿瘤的三大治疗手段之一,随着放射肿瘤学的不断发展以及放疗设备的不断普及,放射治疗在肿瘤治疗中的地位愈显重要。据统计,60%~70%的肿瘤患者在病程的不同时期因不同的目的需要接受放射治疗。放疗是通过射线的直接作用或产生的氧自由基来抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡,从而起到杀伤肿瘤或抑制肿瘤生长的目的。放疗可以抑制绝大多数组织来源的恶性肿瘤的生长。 然而,最近的研究表明,辐射在激活p53等基因抑制肿瘤细胞增殖、存活或诱导其凋亡的同时,还会导致其它多种辐射效应基因的激活,从而激活细胞内复杂的信号网络,引起各种细胞因子的分泌或细胞内蛋白表达的改变,使肿瘤细胞所处的微环境发生改变,存活的肿瘤细胞因自身基因表达的改变或周围环境的改变,其转移和侵袭等生物学行为也发生相应变化。毫无疑问,肿瘤细胞转移和侵袭能力的这种变化将对肿瘤患者的预后产生重要的影响。大量体外研究已经表明,辐射能通过上调肿瘤细胞基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌来增强胰腺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞以及脑胶质瘤细胞的侵袭能力,小鼠的体内研究也证实辐射能促进小鼠肺腺癌细胞的转移。更为重要的是,在临床研究中发现,导管癌放疗患者更易出现侵袭性复发。这些已有研究结果证实放疗在抑制肿瘤细胞生长的同时还存在潜在的促肿瘤细胞侵袭及迁移能力。 肺癌是临床发病率最高的恶性肿瘤,放疗是肺癌的主要治疗手段,但是目前辐射对肺癌细胞侵袭及迁移能力的影响还不清楚。本研究以肺腺癌A549细胞为模型,研究辐射对肺腺癌侵袭及迁移能力的影响,并探讨了辐射促进肺腺癌细胞侵袭及迁移的分子机制。 在本论文中,我们主要进行了以下三个方面的研究: 1.辐射对A549细胞侵袭、迁移等生物学行为影响不同剂量60Coγ射线照射A549细胞后,利用克隆形成率及WST-8细胞活性检测试剂检测A549细胞存活及增殖能力,利用Annexin-Ⅴ/PI双染法检测照射后24 h及48 h的A549细胞凋亡,利用细胞黏附实验检测细胞的黏附能力,利用划痕实验检测细胞的迁移能力,利用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。实验结果表明: (1) 2、4、6 Gyγ射线照射可显著抑制A549细胞的存活及增殖并呈剂量依赖性,6 Gyγ射线照射可诱导A549细胞出现显著的凋亡,2和4 Gyγ射线照射不能在48 h内诱导A549细胞发生凋亡。 (2) 2和4 Gyγ射线照射能显著促进A549细胞的侵袭及迁移,对A549细胞的黏附能力无显著影响。 2.辐射诱导肺腺癌A549细胞侵袭的分子机制 2.1辐射对A549细胞中MMP-2表达及酶活性的影响侵袭过程中,肿瘤细胞必须破坏由细胞间质和基底膜组成的细胞外基质(ECM)屏障,此过程需要多种酶类参与,其中最重要的是可降解基底膜和细胞外基质大多数组分的基质金属蛋白酶(MMP)。在MMPs家族中,MMP-2在肿瘤侵袭及转移中的作用最为突出,且有研究表明,辐射能促进多种组织来源肿瘤细胞中MMP-2的表达。在本部分研究中,我们首先利用半定量反转录PCR检测了2和4 Gyγ射线照射后24 h,A549细胞中MMP-2的转录水平,利用Western blot检测了γ射线照射后24 h,A549细胞中MMP-2蛋白表达变化,同时利用明胶酶谱实验检测了MMP-2酶活性的变化。研究结果表明,2和4 Gyγ射线照射能促进A549细胞中MMP-2的转录,继而引起MMP-2蛋白表达上调,同时A549细胞培养上清中的MMP-2的酶活性也在照射后呈剂量依赖性升高。上述结果表明MMP-2参与了辐射诱导的A549细胞侵袭。 2.2辐射诱导MMP-2升高的上游信号通路STAT3(信号转导子和转录激活子3)属于STATs蛋白家族,它介导多种细胞因子、生长因子信号向细胞核的传导,是众多靶基因的转录因子,其靶基因包括MMP-2、VEGF、Bcl-2等。IL-6/JAK-2/STAT3信号通路是典型的STAT3激活途径,STAT3 705位酪氨酸残基被JAK-2激酶磷酸化后,将发生二聚化并进入到细胞核中,调节靶基因的转录。由于辐射对MMP-2的影响发生在转录水平,因此接下来检测了辐射对STAT3的影响。 利用Western blot检测2和4 Gyγ射线照射对STAT3的表达及磷酸化的影响,并进一步利用Western blot及间接免疫荧光染色检测了γ射线照射对STAT3在细胞核内分布的影响。实验结果表明,2和4 Gyγ射线照射促进A549细胞中STAT3的磷酸化及入核,但是对STAT3的表达无显著影响。在细胞培养液中加入JAK-2激酶特异性抑制剂AG490后,辐射诱导的STAT3磷酸化被阻断,提示STAT3磷酸化依赖于JAK-2。进一步利用Elisa法对A549细胞培养上清中的IL-6进行检测后发现,2和4 Gyγ射线照射可促进A549细胞IL-6的分泌。AG490阻断辐射诱导的STAT3磷酸化后,辐射诱导的MMP-2表达及酶活性升高均被抑制,同时,辐射诱导A549细胞侵袭能力升高也被抑制,上述结果表明,辐射通过促进A549细胞中IL-6的分泌激活IL-6/JAK-2/STAT3信号通路,导致MMP-2表达升高,后者最终导致A549细胞的侵袭能力增强。本研究还发现,A549细胞培养液中加入AG490后,辐射诱导的细胞迁移也被显著抑制,表明辐射诱导的A549细胞迁移也由IL-6/JAK-2/STAT3信号通路所介导。 同时,本研究还表明,辐射诱导的STAT3活化并不发生于其它组织来源的肿瘤(胃腺癌、胰腺癌、肝癌)细胞中。 3.辐射对JAK-2-STAT3信号通路其它靶基因的影响除MMP-2外,STAT3还可以调节血管内皮生长因子VEGF、Survivin、Bcl-2等靶基因的表达,这些基因的表达上调将抑制肿瘤细胞的凋亡,促进血管生成,从而不利于射线对肿瘤的杀伤效应。本部分对这些基因在辐射后的表达及其与STAT3的关系进行了研究。Western blot及半定量PCR结果显示,2和4 Gyγ射线照射可在mRNA及蛋白水平上调A549细胞中VEGF的表达,AG490可抑制辐射诱导的VEGF表达。γ射线照射对A549细胞中Bcl-2的表达无影响,但是可以上调Survivin蛋白的表达,并依赖于STAT3的活化。此结果表明,2和4 Gyγ射线照射可导致肺腺癌局部VEGF浓度升高,这将有助于新血管的生成,从而促进肿瘤的生长,而Survivin的表达升高将为肿瘤细胞提供抗凋亡保护。 本研究的创新之处在于:发现了γ射线照射能促进肺腺癌A549细胞侵袭及迁移这一效应,同时阐明了辐射诱导A549细胞侵袭的信号调节机制:辐射激活A549细胞中的IL-6/JAK-2/STAT3信号通路,导致MMP-2表达上调,后者最终促进的肿瘤细胞的侵袭。


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