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药物致QT间期延长体外HERG通道评价模型的建立及其应用

夏静  
【摘要】:临床使用的许多药物能够引起心脏QT间期延长,导致室性心律失常,增加发生尖端扭转型室性心动过速(Torsade de pointes,TdP)的危险。近十年来,药物诱发QT间期延长已超过肝损伤,成为导致药品撤市的主要原因和制药工业必须面对的首要安全问题。QT间期在细胞水平代表心室肌细胞的动作电位时程(action potential duration,APD)加上传导时间,APD的长短与膜电位的复极化密切相关。快速延迟整流钾电流(the rapidly activating delayed rectifier potassium current,IKr)是动作电位复极期的主要外向钾电流,HERG基因(human ether-a-go-go-related gene)普遍认为编码IKr的α亚单位,其表达形成的HERG钾通道与IKr性质相似。很多实验证实凡是能够诱导QT间期延长,引发TdP的药物,均能够在不同程度上阻断IKr/HERG通道。ICH国际药物研发指导原则S7B于2005年明确提出将IKr/HERG通道作为判断药物是否能延长心室复极化的重要指标。因此,采用膜片钳电生理试验方法进行体外HERG通道检测成为综合评估TdP危险性的重要部分。 目前,HERG通道检测已成为药物早期筛选和安全性药理实验的重要内容。而我国相关试验并未广泛开展,尤其是对中草药致QT间期延长的风险评估严重滞后。近年来,国内外中草药毒性引发心血管不良反应案例频发。基于以上现状,建立药物致QT间期延长的体外HERG通道模型并应用于传统中药(traditional Chinese medicine,TCM)的心脏毒性评估和机制研究,具有重要的理论和现实意义。因此,本研究拟采用全细胞膜片钳技术,建立HERG离子通道模型,并选用具有明显心血管药理活性的中药单体环维黄杨星D和蝙蝠葛碱,对其进行HERG电流抑制作用评价和机制研究。 首先,利用膜片钳全细胞记录技术建立HERG通道模型。采用原代培养心肌细胞,形成全细胞模式后,记录到电压门控性钠、钾、钙电流。利用转染并稳定表达HERG通道的人胚肾细胞株(HEK-293)记录HERG电流。该模型可以直接观察药物对HERG电流的抑制效应。HERG的电流电压关系表明,步阶电流呈“钟型”,-40~+10 mV,随电压的升高,电流幅度迅速增加;+10~+40 mV,由于C型失活,电流幅度随电压升高反而下降。尾电流在去极化时迅速上升,在+10 mV时已接近峰值。以上电流的特点与文献报道基本一致。此外,为判断HERG电流对药物的敏感性,试验采用阳性药物E-4031和特非那定进行有效性验证。E-4031和特非那定均能明显阻断HERG电流,呈剂量依赖性,半数抑制浓度IC50分别为0.042μM和0.038μM,结果与文献报道一致。本部分从电生理和药理学阻断剂两方面均验证了记录电流为IKr,表明药物致心脏QT间期延长体外HERG通道评价模型已成功建立。 在此基础上,本研究利用建立的HERG通道模型,对环维黄杨星D和蝙蝠葛碱进行抑制作用评价。早期心脏毒性筛选时,判断药物对HERG电流的抑制效应一般采用尾电流峰值减小的程度。若尾电流的IC50小于30μM,提示药物可能有导致心脏QT间期延长的危险,需进一步进行体内试验研究。结果表明,环维黄杨星D能剂量依赖性的阻断HERG电流,IC50为19.7μM,约5~6 min达到作用稳态,洗脱后能部分恢复,提示对HERG通道的抑制可能是其延长动作电位时程致心律失常的作用机制之一。蝙蝠葛碱能剂量依赖性的阻断HERG电流,IC50为3.5μM,抑制效应表现迅速,1~3 min达到作用稳态,洗脱后能部分恢复,由于蝙蝠葛碱对多种离子通道均有抑制作用,推测这些离子通道的综合作用延长心室复极时程,降低心肌兴奋性,从而发挥抗心律失常的作用。 进而探讨了环维黄杨星D和蝙蝠葛碱对HERG通道的作用机制。本试验设计了相应的刺激程序,从电压、时间、通道动力学、通道稳态、门控特性等方面观察作用特点。结果表明,环维黄杨星D能抑制-10~+60 mV的部分步阶电流和尾电流,能抑制-50~+20 mV的瞬时失活电流,完全激活电流表明药物对反转电位无明显影响。采用10 s去极化和“envelope of tails”刺激表明环维黄杨星D对电流的影响具有时间依赖性,在400~500 ms阻断作用明显增加,当除极至+80 mV使通道失活时阻断作用降低。提示环维黄杨星D主要作用于通道的开放态。环维黄杨星D对通道激活、瞬时失活、复活和稳态失活等动力学无明显影响。蝙蝠葛碱能抑制-10~+40 mV的步阶电流和-10~+60 mV的尾电流,在+20~+60 mV的抑制程度高于-20~+10 mV,表明具有电压依赖性。蝙蝠葛碱能抑制-50~+20 mV的瞬时失活电流,完全激活电流表明药物能在-100~+20 mV减小电流,反转电位从约-75 mV变为-65 mV,说明影响了离子通道的选择性。采用10 s去极化和“envelope of tails”刺激表明蝙蝠葛碱对电流的影响具有时间依赖性,在前4 s阻断作用逐渐增加。蝙蝠葛碱能使激活曲线左移,半数激活电压V1/2从-14.85±0.2 mV变为-23.13±1.1 mV;使瞬时失活时间常数明显减小,失活速度加快,-40 mV下,τ由14.1±0.7 ms变为9.1±0.5 ms;使复活时间常数明显减小,复活速度加快,-50 mV下,τ由10.1±0.5 ms变为8.1±0.5 ms。当除极至+80 mV使通道失活时阻断作用增加。这些结果提示蝙蝠葛碱能同时作用于开放态和失活态。 综合研究结果,在本实验条件下,可以得到如下结论:①成功建立了药物致QT间期延长体外HERG通道评价模型,并从电生理和阳性药物两方面验证了模型的可靠性。②环维黄杨星D和蝙蝠葛碱均能抑制HERG电流,提示两药均具有延长心肌细胞动作电位时程的作用。③环维黄杨星D对HERG电流的阻断作用需要通道的激活,即主要作用于通道的开放态。④蝙蝠葛碱对HERG电流的阻断效应表现迅速,能同时作用于通道的开放态和失活态。⑤结合半数抑制浓度IC50和临床用药最高血药浓度Cmax,环维黄杨星D在治疗剂量下有很高的安全范围,而蝙蝠葛碱在高剂量用药或是同时服用其它致QT间期延长的药物时,在临床上的使用应引起关注。⑥利用HERG通道模型可以直接评价药物对HERG电流的抑制作用,在药物早期心脏毒性筛选和安全性评价中有良好的应用前景。


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