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RKIP调控的Raf/MEK/ERK信号通路在微波辐射诱导PC12细胞凋亡中的作用

林涛  
【摘要】:目的和意义:随着经济与科学技术的迅猛发展,微波技术已经广泛应用于通讯、广播、医药、军事等各个领域且深入到人们日常生活的各个方面,微波给人类带来极大益处的同时,也给人类健康造成了日益严重的威胁。微波的生物效应及其机制研究是目前生物电磁学的前沿课题。研究表明,中枢神经系统是微波辐射的敏感靶部位,海马是微波辐射损伤的敏感靶区,但其致伤机制尚未阐明。我们前期的研究发现,RKIP调控的Raf/MEK/ERK信号通路可能在微波辐射致海马损伤中发挥重要作用。因此,探讨RKIP对Raf/MEK/ERK信号通路的调控在微波辐射诱导PCI2细胞凋亡中的作用及其机制,对于明确微波辐射损伤效应及阐明其损伤机制,寻找敏感靶标,制定防护标准和提供防治措施部具有重要意义。 材料和方法:(1)采用平均功率密度为30mw/cm的微波辐射诱导分化后的PCI2细胞5 nljn,建立辐射诱导神经细胞的凋亡模型。通过流式细胞术检测细胞凋亡与坏死率及线粒体膜电位,原位末端标记检测凋亡早期DNA断裂;透射电镜和Hoec]nest染色观察细胞超微结构改变及凋亡小体形成;免疫细胞化学检测凋亡基因产物表达。(2)通过实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧光、免疫共定位和图像分忻等技术,动态检测PCI2细胞中RKIP及其mRNA、Ra/MEK/ERK信号通路中关键分子Raf_1、:MEtK、ERK及其下游核转录因子CREB的磷酸化改变,以及RKIP与Raf_1的相互作用。(3)应用MEK的特异性抑制剂u0126研究Ra/MEK/ERK信号通路在辐射诱导细胞凋亡中的作用。(4)分别构建RKIP的正义和反义重组质粒,利用基因转染和RNA干涉技术研究RKIP过表达和基因沉默对Ra/MEK/ERK信号通路的调控在辐射诱导细胞凋亡中的作用,并研究RKIP基因沉默和u0126的拮抗作用。 实验结果:(1)微波辐射诱导Pcl2细胞凋亡模型建立:30mw/cm。微波辐射5min后导致PCI2细胞胞核固缩、深染、较多凋亡小体形成;超微结构呈现部分细胞核染色质浓缩、沿核膜边集,凋亡发生;辐射后6h~3d,细胞凋亡与坏死率较假辐射组均显著升高P0.01),线粒体膜电位明显下降P0.05或尸l0.01);辐射后6h和1d,DNA断裂发生率明显升高P0.01),凋亡基因产物Bcl—2表达减少、B“及Caspase一3表达增加,Bcl—2/Bax的H,J比值明显降低(尸l0.01);(2)RKIP及Raf/MEI(/ERK通路关键分子的表达变化规律:RKIP于分化后的Pcl2细胞胞膜与胞浆均呈阳性表达,其中胞膜呈强阳性表达,辐射后其表达分布明显减少;辐射后6h~3d,假辐射组和辐射组PCI2细胞中RKIP表达变化均呈持续减少趋势,但辐射组较假辐射组始终显著降低P0.05或P0.01),以6h最为显著(P0.01);RKIP mRNA表达于6h时较假辐射组明显下调P0.01),而1d时明显上调P0.01);同时RKIP与Ral:1的细胞共定位信号明显减弱;Raf.1的表达在假辐射组和辐射组两组之间均未见显著性差异;但辐射组p—Ral:1表达于2d和3d时均显著上调P0.05或P0.01);两组ERK表达均未见统计学差异,但p—ERK于辐射组611~3d均显著上调(P0.05或P0.01),并可见核移位发生;辐射组p—CREB表达于611~3d较假辐射组亦显著上调P0.05或P0.01);(3)u0126对RKIP及ERK信号通路关键分子表达的影响:辐射后6h~1d,u0126可明显增强辐射组RKIP的表达P0.01),且显著高于假辐射组P0.01);u0126均能显著抑制辐射后p—MEK、p—ERK及p—CREB的上调(P0.01);而对ERK的表达没有影响;(4)u0126对辐射后凋亡基因产物表达的影响:u0126对辐射后Bcl一2的表达未见明显影响;u0126可明显减弱辐射后6h和1d Caspase一3的表达以及辐射后6h Bax的表达P0.01);(5)RKIP重组质粒构建与Pcl2细胞基因转染:分别采用pcDNA3.0及pGPu6/GFP/Neo载体,以大鼠背根神经节为模扳,成功构建了pc~)NA3.0一RKIP及RKIP shRNA重组质粒,并筛选获得了稳定转染RKIP正义和反义质粒的PC2细胞株;采用非脂质体转染试剂~~igoI,ect介导的重组质粒可高效转染未分化的PCI2细胞,诱导分化后细胞转染效率较高(约80%),从而为开展Pcl2神经细胞基因转染实验提供了可靠技术平台;(6)RKIP对辐射后ERK信号通路的调控作用:辐射后6h和1d,RKIP过表达显著抑制辐射后p—MEK、p—ERK及p—CREB上调P0.01);而RKIP基因沉默对辐射后p—MEK、p—ERK及p—CREB上调具有促进作用;RKIP对辐射后ERK的表达未见明显影响;(7)RKIP对辐射诱导细胞凋亡的影响:辐射后6h和1d,RKIP过表达可明显抑制辐射后细胞凋亡增多P0.01),RKIP基因沉默则导致凋亡进一步增多P0.05);RKIP过表达显著抑制辐射后:Bcl一2下调、Bax及Caspase-一3的上调,RKIP基因沉默则与其作用相反;RKIP基因沉默和u0126对于辐射诱导的细胞凋亡、Bcl一2、Bax及Caspase一3表达改变均具有明显的拮抗作用(P0.01)。 结论: 一、平均功率密度30mw/cm。的微波辐射5min导致PCI2细胞凋亡和坏死率明显升高,细胞核染色质浓缩、DNA断裂、凋亡小体形成,线粒体膜电位下降,建立了良好的微波辐射诱导神经细胞凋亡模型。 二、微波辐射后RKIP表达下调,对Ral7MEK/ERK信号通路的抑制作用减弱,从而导致Rar/MEK/ERK信号通路活化增强。另一方面,RKIP蛋白质翻译后修饰水平的变化可能参与了微波辐射损伤。 三、Ra~7MEK/ERK信号通路活化可促进微波辐射诱导的PCI2神经细胞凋亡,其作用机制与Bcl一2/Bax比值下降及C{aspase一3表达上调有关;u0126可减少辐射所致细胞凋亡,对微波辐射损伤具有一定防护作用。 四、RKIP正义与反义质粒的成功构建及其在PCI2细胞的有效表达为深入研究RKIP的神经生物学功能奠定了良好实验基础,并提供了可靠技术平台。 五、RKIP对微波辐射后Ral7MEK/ERK信号通路的活化具有主要调控作用,这一调控参与诱导辐射所致PCI2神经细胞凋亡,并在其中发挥重要调节作用。RKIP过表达明显减少辐射后细胞凋亡,RKIP基因沉默则导致辐射后细胞凋亡增加。 六、RKIP下调导致CREB活化增强,Bcl一2/:Bax比值下降,Gaspase-一3表达增加,是RKIP调控微波辐射所致细胞凋亡的重要机制。另一方面,RKIP对辐射诱导细胞凋亡的调控机制可能涉及多条细胞信号通路之间的相互对话。


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