收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

H5N1禽流感病毒PB1 T677M 位点与PB2 I63T位点对病毒毒力的影响

李永强  
【摘要】:H5N1亚型禽流感病毒(fdvifdl]int]uenZa vims,AIv)不仅可以感染禽类,而且可以跨越种属屏障感染人或其他哺乳动物,严重威胁人类健康。自1997年高致病性H5N1亚型禽流感病毒跨越种属屏障直接感染人,至2011年2月已有525例感染发病,310例死亡,死亡率大约60%,成为目前令人十分恐惧的病原体之 一,至今,H5N1禽流感病毒对人感染和致病的机制尚不完全清楚。 蚀斑是病毒感染细胞形成的重要特征之一,不同的H5N1病毒株蚀斑特性不同,同一人源H5N1病毒株经过传代后,蚀斑的形态、形成大小也会发生改变。同一来源H5N1病毒株中的不同蚀斑类型病毒,它们的基因序列差异较小,如果不同蚀斑病毒株之间存在致病性差异,较易分忻病毒致病性差异的分子基础。本研究的目的是从H5N1禽流感病毒株A厂\,ietIlam/1194/2004(H5N1) (简称vNll94)蚀斑形成特性入手,利用禽流感病毒在哺乳动物细胞或实验动物传代过程中发生蚀斑大小改变的特性,首先分离纯化蚀斑大小不同的病毒,再感染小鼠观察分离纯化的病毒对小鼠致病力的差异,然后通过致病力差异毒株全基因组序列分忻找出差异基因位点,并利用反向遗传学技术进行进一步验证,探讨H5N1禽流感病毒致病力的分子基础,为禽流感病毒致病分子机制研究探索一条新的思路。 一、致病力差异毒株的分离和序列分析 本研究首先建立了H5N1禽流感病毒蚀斑测定方法,病毒的蚀斑形成测定发现野生型vNll94形成的蚀斑为大小均一的针尖样小斑。接着将vNll94病毒滴鼻感染小鼠传代,取感染组织中的病毒进行蚀斑形成测定,结果显示,在小鼠肺组织的病毒蚀斑特性发生明显的变化,形成大小不均一的混合斑,而在脑组织的病毒蚀斑依然为均一一致的针尖样小斑。之后,通过蚀斑分离纯化技术从肺组织和脑组织中分离得到大斑和小斑病毒,为了观察从不同组织分离纯化的蚀斑形态不同的病毒的致病力是否存在差异,将分离纯化的病毒分别感染小鼠,鉴定病毒对小鼠的毒力。实验证明从鼠肺分离的大斑病毒(MLLl和MLL4分离株)为致病力弱毒株,而从鼠脑分离的小斑病毒(MBl和MB2)为致病力最强毒株。 通过病毒全基因组序列测定,对比致病力差异毒株的基因序列和编码蛋白的氦基酸序列,发现上述4株亚克隆病毒部有氦基酸位点的突变,PB2 163T(PB263位氦基酸由I突变为T)和PBl T677M(PBl 677位氦基酸由T突变为M)为弱毒株MLLl和MLL4的共有突变,而致病力强毒株没有共有的突变位点。 本部分研究,建立了禽流感病毒蚀斑形成测定方法,观察到了vNll94病毒在小鼠中传代后蚀斑性状发生改变和小鼠脑分离病毒均为小斑这些现象。成功从vNll94株感染的小鼠组织中分离得到了蚀斑形态和致病力有差异的多株亚克隆病毒,通过基因组序列和蛋白序列分忻比较,发现了P:B2 163T和PBl T677M是致弱株的共有突变位点,提示这两个突变位点可能与病毒的致病力减弱有关,为下一步研究禽流感病毒致病的分子机制奠定了基础。 二、PBl T677M位点和P B2 [63T位点的功能研究 为确定}t5N1禽流感病毒PB2 163T位点和PBl T677M位点的功能,本研究采用反向遗传学技术拯救位点突变的病毒。首先建立适合禽流感病毒拯救的8质粒系统,利用该系统对野毒株病毒,单一位点突变株病毒和两个位点联合突变株病毒进行了病毒的拯救。通过鸡胚致死性试验、蚀斑试验、特异PCR及全基因组序列测定方法鉴定拯救病毒,并通过感染小鼠测定拯救病毒对小鼠的致病力。 采用8质粒病毒拯救系统,利用反向遗传学技术成功拯救出野毒株(rvNll94)、两个基因位点分别单独突变株(rvNll94:PB2—63T和rvNll94:PBl—677M)和两个位点联合突变株(rvNll94M)4株拯救病毒株。全基因组序列分忻证明获得的4株拯救病毒的基因序列与予页期基因序列一致。拯救病毒对小鼠的致病性试验显示,rvNll94M病毒致病力明显弱于其它3株病毒(rVNll94,rVNll94:PB2—63T和rVNll94:PBl—677M)。rVNll94和rvNll94:PB2—63T毒株对小鼠显示出明显的嗜神经性症状,而rvNll94M和rvNll94:PBl—677M无此症状出现。 实验表明,PB2 163T位点和PBl T677M位点联合突变可使It5N1病毒致病力减弱。结果提示,病毒PBl的T677M突变可能与病毒的神经嗜性或者病毒进入小鼠脑内的能力有关。 三、联合突变使病毒致病力减弱机制的探讨 实验中发现PB2 163T位点和PBl T677M位点联合突变可使病毒致病力减弱,而病毒的致病力与病毒在宿主体内的复制能力相关。为研究联合突变致病力减弱的机制,从多方面,多角度分忻病毒复制能力与病毒致病力的关系。首先,在多株不同组织来源的细胞株上(A549、Neuro一2a和RAW264.7)观察对比了不同位点突变病毒的复制能力方面的差异,结果显示rvNll94M在上述三株细胞的复制能力部低于其他病毒,提示rvNll94M的复制能力较低是导致病毒致病力相对较弱的主要因素之一。接着,在分子水平探讨聚合酶活性与病毒复制能力的关系, 结果表明,在聚合酶蛋白亚基PB2和PBl mRNA表达量无差异的条件下,rvNll94M和rvNll94:PB 1—677M这两株病毒的聚合酶活性明显强于其他两株病毒,分忻发现PB2 163T和PBl T677M位点联合突变的病毒复制能力较弱并非是受聚合酶转录活性低的影响,复制能力较弱机制可能还受其它因素的影响。通过滴鼻感染小鼠观察了突变病毒在小鼠肺、脑组织中病毒复制能力的差异,发现rvNll94M感染鼠肺中病毒载量明显低于其他三株病毒,说明病毒在小鼠肺组织中的载量较低是病毒对小鼠致病力较弱的最重要因素。检测感染小鼠脑组织发现,PBl 677M位点突变的病毒(即:rvNll94M和rvNll94::PBl—677M)感染的鼠脑组织中检测不到病毒,这与我们第二部分这两株病毒感染小鼠临床表现无嗜神经性症状极为吻合,进一步说明,PBl T677M突变可能导致病毒不能进入小鼠脑内。 感染宿主的病理损伤程度是病毒致病力强弱的直观证据,本研究利用拯救获得的双位点突变病毒(rvNll94M)和未突变病毒(rvNll94)感染小鼠,观察比较这两株病毒致小鼠组织脏器的病理损伤情况,从病理学角度分忻PB2 163T和:PBl T677M位点联合突变致病毒致病力减弱的机制。结果显示rvNll94M对小鼠肝组织、肾组织和脾组织的损伤明显轻于rvNll94,并且rvNll94M感染的小鼠在脑内没有检测到病毒抗原。由此可见,:PB2 163T位点和PBl T677M位点联合突变致病毒对小鼠的致病力减弱的病理机制主要是由于其对小鼠肝组织、肾组织和脾组织等的病理损伤减轻以及病毒不能进入小鼠脑组织。 本研究从ft5N1禽流感病毒株蚀斑形成特性入手,分离纯化得到了致病力差异显著的病毒亚克隆株,通过病毒全基因组序列测定和编码蛋白序列分忻找出了基因及蛋白序列的差异位点,揭示出PB2 163T位点和PB 1 T677M位点联合突变可使病毒致病力减弱。研究结果证明,PB2 163T位点和PB 1 T677M位点联合突变病毒对小鼠的致病力减弱与其在小鼠体内复制能力弱、对小鼠的肝、肾、脾等主要脏器造成的病理损伤轻,以及病毒不能进入脑组织有关。同时发现,PBl T677M位点与病毒能否进入小鼠脑组织有关,为揭示禽流感病毒侵蚀中枢神经系统的机理提供了新的理论依据。本研究为禽流感病毒致病分子机制研究和减毒活疫苗研制开辟了一条新的思路,为进一步深入研究禽流感病毒的致病机制提供了新的实验依据。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 温峰琴;樊树芳;胡永浩;邓国华;陈化兰;;H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/Guangxi/53/02株感染性克隆的构建[J];中国兽医学报;2008年05期
2 李誌;刘元宁;张浩;鲁会军;李达;;探讨基于平衡能的禽流感病毒结构分析[J];实验室科学;2010年01期
3 史卫峰;顿爱社;刘帅;张彦周;朱朝东;;生物信息学在禽流感病毒研究中的应用[J];中国病原生物学杂志;2009年03期
4 郭小玲;崔红;王宇;张国广;陈亮;;H5N1型禽流感病毒HA基因在烟草中的表达[J];厦门大学学报(自然科学版);2006年S1期
5 程从升;蓝雨;柳燕;张智清;舒跃龙;姚立红;温乐英;王大燕;王伟;李希妍;王琦;赵新生;黄晶晶;聂凯;张晓光;;人H5N1亚型禽流感病毒安徽株NS1基因的克隆及在原核系统的表达[J];微生物学报;2007年03期
6 雷富民;崔鹏;尹祚华;;禽流感的传播与风险[J];自然杂志;2008年02期
7 沙依兰古丽;李曦;崔尚金;成进;符子华;盛卓君;汪萍;巴格德力;黄大松;;H5N1亚型禽流感病毒新疆株NA基因的克隆及序列分析[J];动物医学进展;2007年12期
8 田国彬;曾显营;钟功勋;姜永萍;李雁冰;施建忠;毛胜刚;冯菊艳;王君伟;陈化兰;;H5N1亚型禽流感变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫原性研究[J];中国预防兽医学报;2009年09期
9 刘娟;方丹云;周经姣;江澜;周俊梅;江丽芳;;H5N1人禽流感病毒HA基因的克隆和表达[J];苏州大学学报(医学版);2009年04期
10 雷富民,赵德龙;野生鸟类对禽流感爆发与传播的影响[J];中国科学院院刊;2005年06期
11 王桂军;邵红霞;金文杰;秦爱建;;禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达[J];安徽农业科学;2008年32期
12 房师松;何建凡;程小雯;吕星;逯建华;张顺祥;;泛太平洋西岸地区部分H5N1亚型禽流感病毒毒株血凝素基因特性的研究[J];卫生研究;2008年04期
13 雷富民;赵德龙;;野生鸟类对禽流感爆发与传播的影响[J];生物学通报;2006年01期
14 索永兵;樊树芳;邓国华;温峰琴;希尼尼根;陈化兰;;H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/duck/FuJian/01/02株反向基因操作系统的建立[J];农业生物技术学报;2009年03期
15 吴新伟;李向忠;王玉林;伍业健;蒋力云;岳锦亚;柳洋;刘于飞;王鸣;杨霞;;广州市一起水禽H5N1疫情禽流感病毒血凝素基因分析[J];热带医学杂志;2008年08期
16 杨佳琳;夏菡;赵九如;何晓斌;潘丽敏;唐霜;张忠;寇铮;李天宪;;20世纪80年代华中地区H7N8禽流感病毒的分子特征[J];科学通报;2010年12期
17 罗海峰;陈毅歆;陈自敏;郭永利;王嘉;张军;陈鸿霖;管轶;夏宁邵;;一株抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的广谱中和活性[J];病毒学报;2007年02期
18 史卫峰;杨娜娜;陈栋;金旭;张彦周;朱朝东;;2004年山东分离的一株H5N1禽流感病毒被检测为X基因型(英文)[J];生命科学研究;2007年02期
19 顿继凤;周迎春;蒲娟;刘金华;;H5N1亚型禽流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒系统中表达与活性鉴定[J];农业生物技术学报;2007年04期
20 张继荣;赵德龙;尹祚华;雷富民;;H5N1高致病性禽流感病毒的危害及生态问题[J];动物学杂志;2007年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张国良;沈丽;陈心春;曾贞;刘成海;聂广;周伯平;;基于假病毒技术的抗H5N1禽流感病毒中药筛选平台的建立及评价[A];全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编[C];2010年
2 陈化兰;;中国H5N1禽流感病毒的进化和疫苗研究研制及应用[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
3 张瑞莉;郑世民;;鹅源H5N1禽流感病毒在感染雏鸡心脏的分布及所致病理变化[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
4 黄淑坚;廖明;辛朝安;;鹅源H5N1亚型禽流感病毒对鸡的致病性研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年
5 刘叔文;李润明;张瑞涛;朱志博;郑伯建;;CL-385319作用于H5型血凝素蛋白抑制H5N1禽流感病毒的感染[A];第十届全国抗炎免疫药理学学术会议论文集[C];2010年
6 黄安国;蒋玉雯;盘宝进;陈西宁;白安斌;姚瑞英;;鹅源高致病力禽流感病毒的分离和鉴定[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
7 钟静;黄平;李海涛;;广东人类禽流感H5N1亚型血凝素和神经氨酸酶基因溯源分析[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年
8 张洪军;;禽流感后养禽业如何走出低谷[A];“科技进步推进畜牧业现代化”科技论文集[C];2011年
9 单芬;郑煦灿;韦良孟;徐成刚;罗开健;任涛;辛朝安;焦培荣;廖明;;一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
10 李艳华;佟恒敏;于康震;;抗禽流感病毒中草药的研究[A];中国畜牧兽医学会2003年学术年会论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 鞠湘武;H5N1型禽流感病毒损伤细胞溶酶体的机制研究和南极极端环境下科考队员的应激反应研究[D];北京协和医学院;2012年
2 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年
3 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
4 邓明俊;免疫PCR检测低含量H5N1禽流感病毒方法的建立及初步应用[D];西北农林科技大学;2010年
5 李永强;H5N1禽流感病毒PB1 T677M 位点与PB2 I63T位点对病毒毒力的影响[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
6 张国良;整合H5N1禽流感病毒HA、NA蛋白的假型逆转录病毒构建及应用[D];武汉大学;2011年
7 杜海莲;禽流感病毒(H5N1)基因(h5n1a)在马铃薯中的转化与表达研究——附:乙肝表面抗原(HBsAg)基因转化的对比研究[D];福建农林大学;2000年
8 李呈军;中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究[D];中国农业科学院;2005年
9 侯小强;促炎细胞因子及p53蛋白在哺乳动物禽流感致病中的作用研究[D];吉林大学;2010年
10 张涛;融合蛋白介导抗H5N1禽流感病毒靶向制剂研究[D];北京协和医学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
2 赵会连;不同处理和不同保存时间对重组(H5N1亚型,Re-5株)禽流感病毒效力的影响[D];河南农业大学;2010年
3 时永琦;禽流感H5N1病毒分子进化分析及其检测方法的研究[D];郑州大学;2007年
4 吕雪峰;禽流感病毒(H5N1)卵黄抗体制备及相关生物学特性的初步研究[D];吉林大学;2007年
5 刘红彦;H9N2 AIV的NS1基因原核与真核表达及NS1蛋白对几种细胞凋亡的影响[D];西北农林科技大学;2010年
6 孙宇;禽流感病毒血凝素的分离纯化以及快速评估其宿主特异性方法的研究[D];西北大学;2010年
7 宋晓晖;H5N1亚型禽流感病毒HA1基因在大肠杆菌中的表达与纯化[D];中国农业大学;2003年
8 尚璇;H5N1亚型禽流感防疫中应用生物信息学研究免疫方案的探讨[D];华中科技大学;2007年
9 王建琪;禽流感野鸭源分离株H2N2亚型和H3N8亚型基因特征及遗传进化分析[D];东北林业大学;2011年
10 温峰琴;高致病性禽流感病毒A/Duck/Guangxi/53/02株感染性克隆构建及分子演化研究[D];甘肃农业大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 卞晨光;国际社会应继续关注H5N1禽流感病毒[N];科技日报;2010年
2 张孟军;禽流感病毒H5N1正在突变[N];科技日报;2004年
3 记者 何德功;日本确认岛根县禽流感病毒为H5N1型[N];新华每日电讯;2010年
4 记者 黄海敏;越南成功破译H5N1型禽流感病毒中N1型病毒基因序列[N];新华每日电讯;2004年
5 黄恒;泰禽流感病毒基因图谱绘制完成[N];医药经济报;2004年
6 黄海敏;越南破译禽流感病毒N1亚型基因序列[N];医药经济报;2004年
7 华伟;世界首个禽流感病毒H5N1快速诊断药盒试剂盒研制成功[N];中国食品质量报;2004年
8 黄敏;越破译禽流感病毒基因序列[N];中国医药报;2004年
9 黄恒;泰绘制出禽流感病毒基因图谱[N];中国医药报;2004年
10 记者 黄海敏;越南:人禽携带禽流感病毒基因几乎相同[N];新华每日电讯;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978