产紫青霉G59的庆大霉素抗性筛选与突变株新产抗肿瘤活性产物研究

【摘要】：微生物次级代谢产物具有多种多样的生物活性,是新药及其先导化合物的重要来源。然而随着大量活性产物被发现,在常规培养条件下,通过随机筛选得到活性新化合物的几率越来越低。活性筛选后绝大多数菌株往往因无活性而不能直接用于活性产物研究,造成菌株资源和前期投入的极大浪费。因此,通过微生物次级代谢功能改造将无活性菌株转化为活性菌株,更大限度地开发其基因资源,生产更多的活性新产物成为我们研究关注的焦点。 与核糖体工程相关的氨基糖苷类抗生素(AGs)抗性筛选技术已广泛应用于原核微生物(细菌、放线菌等)的次级代谢功能改造和菌种选育。而真菌特殊的细胞壁膜结构和真核微生物对AGs的不敏感性阻碍了该技术在真菌上的应用。本研究利用DMSO介导的方法提高真菌细胞壁膜通透性,促进氨基糖苷类抗生素进入其细胞内部发挥作用,激活与次级代谢相关的生物合成调控系统,从而生产出原始菌所不能生产的次级代谢产物。本文将利用上述方法获得抗生素抗性突变株,通过体外抗肿瘤、抗真菌活性筛选获取活性突变株,并进一步阐明活性突变株中的新产活性产物。 本文以采自渤海湾驴驹河潮间带海泥样品中的无活性产紫青霉(Penicillium purpurogenum) G5(9100μg/mL样品浓度下对K562细胞的抑制率为4.8%,1000μg/mL样品浓度下对K562细胞的抑制率为6.9%)为原始菌株,采用DMSO介导庆大霉素抗性筛选方法,根据菌落形态、色素颜色等外观特征差异,共纯化得到181株抗性突变株,其中20% DMSO介导的庆大霉素抗性突变株136株、50% DMSO介导的庆大霉素抗性突变株45株。对所得突变株发酵液乙酸乙酯萃取样品的抗肿瘤活性筛选结果表明:经过活性初筛和复筛,100μg/mL样品对K562细胞抑制率都大于30%的抗肿瘤活性突变株有9株,阳性率为5%(9/181)。其中,20% DMSO介导的2株、50% DMSO介导的7株。抗真菌活性筛选(纸片法)结果表明,1000μg/片时,对Candida albicans ATCC 10231显示出抑菌活性的突变株有2株(突变株F-10-20和2-10-1-1),抑菌圈约为10 mm,其余突变株未显示出抑菌活性。上述活性突变株与原始株相比,无论在菌落形态、孢子颜色、培养基底部色素沉积等外观特征,还是代谢产物的TLC斑点都有显著的差异。上述研究表明,采用DMSO介导抗生素抗性筛选的方法可以实现对无活性野生真菌的次级代谢功能改造,使突变株生产出原始菌所不能生产的活性代谢产物,从而有效拓展药用真菌菌株资源。 从上述9株抗肿瘤活性突变株中,选取和原始菌代谢产物差异较大且遗传稳定的2株突变株5-1-4和2-5-3-1分别进行了活性产物的研究。首先通过发酵时效考察确定了这两株突变株的最佳发酵时间。在此基础上,对突变株进行大量发酵,并对发酵物进行提取制备,得到活性浸膏。采用活性跟踪与化学检测相结合,从微量预试到放大制备的分离模式,组合利用硅胶层析、Sephadex LH-20柱层析和HPLC等多种色谱技术分离纯化突变株代谢产物中的活性成分。对所得到得单体化合物利用各种现代波谱技术(MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMQC、HMBC)进行化学结构鉴定,采用MTT法测定各化合物对K562细胞的增殖抑制活性。按照上述方法,从突变株5-1-4中分离得到5个化合物,波谱学鉴定了4个,分别为janthinone(1)、fructigenine A(2)、aspterric acid methyl ester(3)和桔霉素(4,citrinin);从突变株2-5-3-1中也分离得到5个化合物,波谱学鉴定了4个,分别为麦角甾醇(5,ergosterol)、rugulosuvine A(6)、大黄素(7,emodin)和ω-羟基大黄素(8,citreorosein)。化合物1~8在100μg/mL浓度下对K562细胞的抑制率分别为34.6%、60.8%、31.7%、67.1%、52.8%、41.2%、84.6%和37.1%。细胞形态镜检结果也表明,8个化合物对K562细胞作用24 h后,细胞形态与空白相比均表现出不同程度的细胞毒活性,其中,化合物2、4、5和7作用较明显。活性产物基本可以代表相应突变株总样品的活性。 综上,本文利用DMSO介导庆大霉素抗性筛选的方法对无活性野生产紫青霉G59进行的次级代谢功能改造,共获得突变株181株。其中有9株突变株遗传稳定且发酵液乙酸乙酯萃取物的抗肿瘤活性大于30%。从这些活性突变株中选取2株进行了代谢产物的活性跟踪分离,共分离鉴定了8个化合物,均对K562细胞具有一定的增殖抑制活性,基本代表了突变株发酵样品的活性。 上述研究结果表明,DMSO介导庆大霉素抗性筛选应用于改造无活性野生真菌的次级代谢是可行的。对于拓展药源活性真菌菌株资源,发现新活性化合物乃至活性新化合物都具有重要意义。