4-氨基哌啶类化合物ZC88抗肿瘤活性及机制的研究

【摘要】：ZC88是我所药物化学研究室以4-氨基哌啶为母核、N型钙离子通道为靶标合成的一个新型候选化合物。前期的研究表明,ZC88对HEK-293细胞表达的N型钙离子通道有浓度依赖性阻断作用,半数抑制浓度(IC_(50))是0.45±0.99μM。体内实验表明ZC88对神经病理性疼痛表现出良好的镇痛作用,目前已对ZC88的结构和用途申请了专利保护。我室在研究ZC88的分子作用机制时,发现ZC88除了具有N型钙通道阻断作用外,初步的筛选还表明ZC88可能对hERG钾通道的具有阻断活性。药物对hERG钾通道的阻断作用可能会带来两方面的影响。一方面,hERG钾通道的活性参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭迁移以及肿瘤的发生发展的过程,阻断hERG钾通道能抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移等病理过程;另一方面,阻断hERG钾通道有可能引起心脏QT间期延长,进而产生诱发致死性心律失常的风险。研究表明,心肌细胞动作电位时程(APD)和QT间期受多种离子通道的调节,仅仅阻断hERG钾通道而引起心肌细胞复极延迟本身并不一定能致心律失常。为此,本研究进一步研究了ZC88对hERG钾电流的影响,考察了ZC88在体内体外的靶向hERG钾通道的抗肿瘤活性和作用机制,评价了ZC88对豚鼠心电图QTc的影响,旨在对ZC88的靶向性抗肿瘤作用及安全性进行前期的探讨,为ZC88成为抗肿瘤药的可能性奠定可靠的研究基础。由于具有致心律失常风险的小分子化合物常作用于hERG钾通道孔洞内部结构位点,当通道关闭时药物内陷孔道的前庭部位,延长药物与通道的作用时间,可能是药物阻断hERG钾通道产生致心律失常风险的主要原因。肽类药物分子较大,不易进入hERG钾通道孔洞,寻找结合于hERG钾通道细胞外结构并具有阻断作用的先导肽或许能规避药物致心律失常的风险。本研究以hERG钾通道第一、三细胞外环为靶蛋白,利用噬菌体随机展示技术,从噬菌体展示随机七肽库中筛选与hERG钾通道结合并有特异性阻断作用的活性小肽,以期能获得一个既能有效阻断hERG钾通道又能规避致心律失常风险的活性先导肽,为靶向hERG钾通道抗肿瘤药物的研发提供前期的物质基础。 研究结果: 1、在爪蟾卵母细胞上成功的表达了hERG1a、hERG1b钾离子通道,使用双电极电压钳技术记录到hERG1a、hERG1b钾电流。在未注射cRNA的爪蟾卵母细胞上,去极化刺激能诱发出一个幅度较小的内源性电流,而在注射有hERG1a cRNA、hERG1b cRNA的卵母细胞上分别可诱发出一高大延迟的外向电流,幅度均在450 nA左右,两种电流均具有内向整流特性。25μM hERG钾通道阻断剂奎尼丁能明显抑制两种电流,对hERG1a、hERG1b钾通道尾电流峰值的抑制分别为75.3%和80.7%,两种电流具有相似翻转电位,为-95.18±2.31 mV(n=4)。根据文献报道,两种电流性质与hERG1a、hERG1b钾电流一致,从而确定表达出的电流是hERG1a、hERG1b钾电流。hERG1a、hERG1b钾电流的半数激活电压分别为-17.06±1.17 mV、-23.61±1.36 mV (n=4或5)。胞外钾离子能明显影响hERG1a、hERG1b钾通道的电流幅度,两种通道电流幅度与钾离子浓度成线性关系增大,尾电流变化没有明显的规律。hERG1a、hERG1b钾电流的去激活速率呈电压依赖性增大,与hERG1a钾电流相比,hERG1b钾电流表现出快速去激活的特性,表明hERG1b钾通道的关闭速度快于hERG1a钾通道。hERG1a、1b钾通道电生理学特性的不同提示药物对两种通道的作用可能会表现出一定的差异性。 2、ZC88能浓度依赖性阻断爪蟾卵母细胞表达的hERG1a和hERG1b钾电流,半数抑制浓度(IC_(50))分别为35.86±2.48μM和21.97±2.13μM (n=3),ZC88对hERG1b钾电流的阻断作用强于hERG1a。50μM ZC88能影响hERG1b钾电流的半数激活电压,从对照电流的-23.11±1.11 mV (n=4)提高到-20.34±0.96 mV (n=4),表明ZC88能加快hERG1b通道的关闭速度,但对hERG1a钾通道的激活和关闭没有影响。ZC88同样能浓度依赖性的抑制HEK293细胞表达的hERG1a钾电流,半数抑制浓度(IC_(50))为11.70±1.69μM (n=6)。ZC88对hERG1a和hERG1b钾电流阻断作用程度的不同及对通道动力学活性影响的差异,提示仅仅使用hERG1a钾通道表达模型来评价药物的致心律失常风险可能是不全面的,未来可能应该使用hERG1a和hERG1b共表达的钾通道模型,以求更好的模拟出药物对生理条件I_(kr)的影响。 3、Western boltting和PCR结果显示在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和结肠癌HT-29细胞中hERG钾通道高表达,而在肺癌细胞A549、H1299、H157中没有发现hERG钾通道表达的证据。使用SRB法,我们检测ZC88对上述五种细胞生长活力的影响,25μM的ZC88对SH-SY5Y、HT-29、A549、H157和H1299细胞生长活力的抑制率分别是91.2±1.3%、81.1±3.1%、62.5±8.8%、53.9±6.7%、31.4±2.8% (n=3),半数生长抑制浓度(GI50)分别是12.9±0.5μM、13.7±0.62μM、22.1±1.4μM、26.1±1.5μM、31.5±1.5μM (n=3),表明ZC88对表达了hERG钾通道的肿瘤细胞的抗增殖作用较没有表达的肿瘤细胞更强,提示ZC88具有靶向hERG钾通道的抗肿瘤作用。 4、成功构建HEK293 hERG稳定转染细胞株,25μM的ZC88对HEK293、HEK293 hERG细胞生长活力的抑制率分别是67.98±2.15%、94.08±1.70%,GI50分别是27.61±2.32μM、15.93±1.00μM (n=3)。25μM ZC88对CHO hERG DUO稳定转染细胞株和CHO-K1细胞生长活力的抑制率分别是79.11±2.28%和57.82±1.22%,半数生长抑制浓度分别为12.16±0.93μM、22.69±0.99μM (n=3)。50μM N型钙离子通道拮抗剂齐考诺肽对SH-SY5Y细胞的生长活力没有影响,表明ZC88对肿瘤细胞生长抑制作用与其阻断hERG钾通道的作用有关,与其对N型钙离子通道的阻断作用无关。 5、ZC88对SH-SY5Y细胞周期分布的影响具有浓度依赖性。0、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM的ZC88作用于SH-SY5Y细胞24 h后,SH-SY5Y细胞处于G0/G1期的细胞数分别为40.80%、43.45%、45.71%、48.87%、62.04%,表明ZC88能浓度依赖性的将SH-SY5Y细胞阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂。 6、ZC88急毒实验表明ZC88对小鼠的半数致死量(LD_(50))为166.04±12.42 mg/kg,中毒表现为毛发竖立、凌乱,活动减少,进食减少、全身震颤,500 mg/kg能使小鼠完全死亡,中毒死亡率没有明显的性别差异。 7、ZC88对SH-SY5Y细胞移植瘤模型瘤体的生长速度具有明显的抑制作用,表现出一定的剂量依赖性。裸鼠皮下注射SH-SY5Y细胞成瘤后,采用腹腔注射方式,分别一次性注射生理盐水、25 mg/kg ZC88或50 mg/kg ZC88,隔日测量瘤体大小。观察2周后,与给药前相比,生理盐水组瘤体增长约36.81倍,25 mg/kg组增长约26.27倍,50 mg/kg组增长约6.80倍,50 mg/kg组的相对肿瘤增殖率T/C(%)为20.6%,表明ZC88具有良好的体内抗肿瘤活性。 8、50 mg/kg ZC88可以使豚鼠心电图QTc(校正的QT间期,减少心率对QT间期的影响)明显延长,20 mg/kg、30 mg/kg ZC88对豚鼠心电图QTc没有明显影响。腹腔注射给予豚鼠50 mg/kg ZC88,观察5、10、15、30、45 min后,50 mg/kg ZC88使豚鼠心电图QTc间期延长了1.12±3.59%、7.97±3.33%、9.95±2.61%、18.74±5.15%(n=5),具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。根据剂量换算,ZC88对裸鼠抗肿瘤的有效剂量50 mg/kg相对于豚鼠20 mg/kg,提示在ZC88的有效剂量下,对心肌细胞的电活动没有明显影响。 9、选择hERG1a钾通道的第一个细胞外环(L1)和第三个细胞外环(L3)作为噬菌体展示7肽库筛选的结合靶标,利用PCR技术,以hERG 1a/pGH19质粒为模板获取L1和L3片段的基因序列,构建L1/pEGX-4T-2和L3/pEGX-4T-2原核表达质粒,使用原核系统表达技术在体外表达出GST、GST L1和GST L3融合蛋白。对噬菌体展示7肽库进行3轮筛选后,利用GST L1融合蛋白筛选到的噬菌体克隆没有发生富集现象;而利用GST L3融合蛋白筛选得到的噬菌体克隆得到了明显的富集,第3轮筛选得到的噬菌体克隆约为第1轮筛选的138倍。从GST L3融合蛋白亲和筛选得到的噬菌体克隆中随机挑选了25个阳性克隆测序,得到3个不同的有效序列,利用ELISA检测阳性克隆与靶蛋白的亲和性,利用GST L3蛋白筛选得到的阳性克隆对L3蛋白呈现出良好的特异性和结合力。将3个有效序列进行小肽合成,使用全自动膜片钳检测小肽的生物学活性,结果显示3种小肽均有对hERG 1a钾电流抑制作用,该阻断作用具有浓度依赖性,半数抑制浓度(IC_(50))分别为652±25.8 nM(n=4)、517±23.5 nM(n=4)、531±14.35 nM(n=4),表现出较强的生物活性,为开发靶向hERG钾通道先导肽及其抗肿瘤机制的研究提供前期的物质基础。 结论: 新型的4-氨基哌啶类化合物ZC88能浓度依赖性阻断爪蟾卵母细胞表达的hERG1a、1b钾电流,对hERG1b钾电流的阻断作用要强于hERG1a,ZC88能加快hERG1b钾通道的关闭速度而对hERG1a钾通道的关闭速度没有影响。体外试验表明,ZC88具有靶向hERG钾通道抗肿瘤活性,通过将肿瘤细胞浓度依赖性阻滞在G0/G1期,抑制肿瘤细胞的有丝分裂。其抗肿瘤活性与肿瘤细胞hERG钾通道的表达水平有关,而与其N型钙离子通道阻断作用无关。ZC88在裸鼠体内移植瘤模型表现出较好的抗肿瘤活性。单次腹腔注射给予ZC88 50mg/kg,可明显降低瘤体的生长速度,相对肿瘤增殖率T/C(%)为20.6%,显示出良好的抗肿瘤活性。进一步评价ZC88对豚鼠心电图QTc的影响表明,ZC88抗肿瘤有效剂量可能并不会产生致心律失常的风险,提示ZC88抗肿瘤治疗具有较好的安全性。另外,从噬菌体展示7肽库中,成功的筛选到3个能与hERG1a钾通道特异性结合的小肽,对hERG钾电流均具有较强的阻断作用,为开发靶向hERG钾通道先导肽及其抗肿瘤机制的研究提供前期的物质基础。