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不同来源间充质干细胞治疗小鼠放射性肺损伤的研究

申戈  
【摘要】:放疗是胸部肿瘤有效的治疗手段,放射牲肺损伤则是常见的并发症。放射性肺损伤分为早期急性损伤及放疗3个月后发生的晚期损伤,严重影响患者的生活质量,甚至导致死亡。目前急性期损伤的治疗多用大剂量糖皮质激素对症处理,由此会引起糖尿病、股骨头坏死等严重并发症;晚期放射性肺损伤生过程相对缓慢,症状多在照射后3-6个月才明显,此时肺放射性纤维化已形成,最佳治疗时机已经错过,有效治疗很少。如果有早期预测指标,及时采取措施,则可减少放射性肺炎的发生。目前临床急需预防及治疗放射性肺损伤有效、低毒的手段,同时也需要有效、易行的预测指标。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是干细胞家族的重要成员,可取材于多种组织,包括小鼠骨片、骨髓、胚胎肺及背主动脉区等部位,同时人源性MSC的研究也越来越多,如人脐带、羊膜等来源。MSC在体内或体外特定的诱导条件下,可诱导分化为脂肪、软骨、心肌以及肺上皮等多种组织细胞,其免疫调控作用也受到重视。 本研究目的是分离、培养出鼠源及人源不同取材部位的MSC,并将MSC输注给放射性肺损伤的小鼠模型,在不同时间点对比疗效,探索多种观察指标,为MSC用于放射肺损伤的临床治疗提供参考。 一、本研究首先从小鼠骨髓、胚肺及胚胎背主动脉区分离、培养MSCs,比较MSC对小鼠放射性肺损伤的治疗作用。将25只8-10周龄C57BL/6雌鼠分为5组:正常组、单照组、骨髓MSC治疗组、胚肺MSC治疗组、胚胎背主动脉(DA)区来源MSC治疗组,观察照射后5个不同时间点(照射后4周、9周、13周、17周、23周)各组小鼠外观、肺组织的病理变化。小鼠胸部照射剂量为单次18Gy。结果:小鼠外观评分均值顺序为正常组(10±0分)、DA组(8±0.71分)、胚肺组(7.6±0.57分)、骨髓组(6.1±1.75分)、对照组(4.8±0.84分),正常组明显好于各组,均为p0.01,单纯放疗组明显差于DA组、肺MSC组,均为p0.01。DA组、肺MSC组及骨髓组的两两配对t检验均为p0.05。肺病理镜检肺损伤评分均值由好到差的顺序为:正常组(0.12±0.16)、肺MSC组(0.22±0.1)、骨髓MSC组(0.33±0.18)、DA组(0.35±0.18)、对照组(0.54±0.27)。肺病理图像分析肺间质面积所占比例由好到差顺序为:正常组(64.3±1.6)、肺MSC组(76.1±2.8)、DA组(76.8±3.3)、骨髓MSC组(77.2±2.7)、对照组(80.8±3.5)。外观评分与病理镜检的相关性检验p=0.040,与图像分析的相关性检验p=0.039。结论:不同鼠源MSC均有减轻放射性肺损伤的作用,其作用效果相似,胚肺、DA区来源的略好。 二、本部分研究对鼠源MSC的治疗作用进行验证,同时检测了血液及肺组织的指标。将40只8-10周龄C57BL/6雌鼠随机平均分为4组(正常对照组、单纯照射组、胚肺MSC治疗组、DA区MSC治疗组),在两个时间点(4、8周)检测。小鼠胸部照射剂量为单次18Gy。观察小鼠外观并评分,光镜下观察肺损伤情况。用ELISA法检测小鼠血浆中TGF-β、IL-6的水平,并检测肺组织中羟脯氨酸的含量。结果:外观评分第4周时各组无显著差别,第8周时差别显著,其中正常组9.6±0.9,明显好于DA组(7.6±0.9,p=0.008)、胚肺组(7.8±0.4,p0.001)、单照组(6.6±0.5,p0.001),单照组差于DA组(p=0.066)、胚肺组(p=0.005),DA组与胚肺组相似(p=0.374)。病理检测评分第4周正常组0±0,明显好于DA组(0.19±0.05,p0.01)、胚肺组(0.29±0.22,p=0.019)、单照组(0.38±0.35,p0.001);第8周正常组为0.06±0.08,明显好于DA组(0.26±0.17,p=0.044)、胚肺组0.23±0.10,p=0.016)、单照组(0.30±0.18,p=0.025)。胚肺组、DA组、单照组的病理评分组间比较在第4周、第8周均无显著差异。IL-6水平(pg/ml)正常组(489.3±75.3、421.2±80.1)、单照组(437.9±87.1、398.1±116.3)在两个时间点的比较及组间比较均无显著差别。TGF-β1水平(pg/m1)正常组两个时间点分别为20.2±12.8、16.3±4.6,p=0.542;DA组值有下降,分别为27.5±13.5、12.4±2.6,p=0.039;胚肺组分别为15.5±8.4、28.3±18.4,p=0.194;单照组分别为9.0±2.8、31.5±27.9,p=0.110。小鼠肺的羟脯氨酸含量(ng/ml)各组间差别不明显,各组4周时含量明显低于8周时含量,正常组分别为812.9±68.4、1080.8±189.5,p=0.018;DA组为823.3±14.6、1266.4±76.9,p0.01:胚肺组为796.2±62.7、1234±153.9,p0.001:单照组为839.0±17.0、1260.9±218.0,p=0.003。结论:小鼠不同来源MSC对放射性肺损伤有治疗作用,外观评分差异明显,病理评分中仅正常组显著好于其他组,其他各组间比较差异不显著,TGF-β1及IL-6检测有待进一步研究,羟脯氨酸水平随时间的变化明显升高,反应了肺损伤后期纤维化情况。 三、分离、培养人羊膜间充质干细胞(amnion MSC, AMSC)及脐带(umbilical cord MSC, UMSC),并进行表型鉴定。分别将AMSC及UMSC移植给胸部照射的小鼠观察疗效。共46只8-10周龄C57BL/6雌鼠分为4组、两个时间点(7周及11周),正常对照组11只(5+6)、单纯照射组(5+6)、人羊膜MSC治疗组(AMSC组)(7+8)、人脐带MSC治疗组(UMSC组)(4+5)。小鼠胸部剂量为单次20Gy。通过外观及病理表现比较各组的损伤情况,并用CBA法检测血浆中不同时间点的多种细胞因子,包括IL-6、IL-I0、MCP-1等。结果:移植了人源MSC的小鼠均未出现意外死亡或其他不良事件,表明人源MSC对小鼠有很好的安全性。照射后第7周、11周外观评分正常组为9.8±0.4及10±0,明显好于单照组8.2±0.4及8.0±0、AMSC组8±0.6及7.8±0.5、UMSC组8.3±0.5及8.0±0.5。单照组、AMSC组及UMSC组间无显著差别。第7周、11周病理镜检评分正常组0.06±0.05及0.12±0.05、UMSC组0.11±0.01及0.12±0.04、AMSC组0.14±0.09及0.14±0.06、单照组0.18±0.06及0.19±0.08,统计学均无显著差别。 正常组的6种血浆细胞因子水平第11周与第7周相比均无显著差别。受照射的各组有多种细胞因子在第11周的血浆水平明显低于第7周的水平。第7周单照组的血浆细胞因子水平均明显升高于正常组,第11周各组间血浆因子水平均无显著差别。细胞因子水平的变化表明除正常组外,各组均出现了炎性反应。 本研究的创新点:1.用外观评分、肺组织病理及图像分析等综合方法判断小鼠肺损伤程度。2.发现鼠源MSC对放射性肺损伤有明确的治疗作用。3.人源MSC移植于普通的C57BL/6小鼠后有很好的安全性。4.用CBA法检测血浆细胞因子是观察炎性反应较好的方法。5.成功建立了小鼠放射性肺损伤的模型,初步分析了影响因素。 总之,鼠源MSC对放射性肺损伤有明确的治疗作用。外观评分、病理表现及血液学检测可作为观察方法对照射损伤进行评估。人源MSC对小鼠有很好的安全性,疗效需要进一步确定。


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