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用于食品中李斯特细菌检测的纳米微悬臂梁传感器技术的研究

韩乐  
【摘要】:1986年原子显微镜的发明在生物技术和纳米技术领域内产生了新的传感技术:悬臂梁。由于这种技术对所检测的样品具有高度敏感性,目前对于悬臂梁传感器的研究越来越受到了关注。这种类型的传感技术在物理和生化方面的检测应用日益增多。本文深入的研究了面向基因检测的两种压阻式悬臂梁传感器,即硅微悬臂梁传感器和二氧化硅微悬臂梁传感器。在设计,制造以及测试这两种微悬臂梁传感器的基础上,研究了微悬臂梁传感器应用于基因检测的方法和特性。 本论文分为两个部分生物样品的准备和传感器的研究。 在生物样品的准备方面我们设计了检测李斯特细菌hlyA毒力基因探针,针对hlyA基因对李斯特细菌进行细菌基因组DNA的提取,并作PCR反应扩增所提取的基因,为了验证扩增出的基因片段为hlyA毒力基因,我们构建重组质粒pMD-18T/hlyA进行克隆,并鉴定。利用所设计的基因探针与扩增出的PCR反应产物进行斑点杂交来检测样品与探针之间的特异性。 从LM中扩增出hlyA基因,构建出了原核表达载体pGEX-3X/hlyA,并在大肠杆菌中表达了LLO蛋白,通过Factor Xa切割所表达的融合蛋白的GST片段从而获得了高纯度的LL0,利用所表达的蛋白免疫动物获得了多克隆抗体。并运用Western blot对感染有LM的兔子与阳性表达的蛋白进行免疫学检测。结果发现了与预期分子量相一致的蛋白条带。 对两种悬臂梁传感器的理论模型和设计进行优化。对于硅微悬臂梁传感器,基于连续层合薄板模型,针对灵敏度和分辨率系统地分析和优化了设计参数:对于二氧化硅微悬臂梁传感器,提出了表面应力负载时的非连续层合薄板模型,优化了设计参数。并对二氧化硅微悬臂梁传感器的自加热效应进行了研究。为有效地降低自加热效应所产生的噪声,设计了差分模式来记录二氧化硅微悬臂梁的电阻信号。 利用所研制的微悬臂梁传感器,设计了基因检测的方案,实现了对李斯特细菌毒力基因hlyA的检测。研究了采用自组装单分子膜在悬臂梁表面的修饰方案,并采用了XPS(X射线光电子能谱)进行验证;在完成了表面修饰后,实现了对李斯特细菌毒力基因hlyA基因的检测。P型二氧化硅微悬臂梁传感器对于基因的检测的检测限为:0.1μg/mL,硅微悬臂梁传感器对于李斯特细菌的最低检测限为:1.0μg/mL.与理论分析相一致。为了验证传感器对于所检测基因的高度选择性,利用与基因探针序列完全不互补双链DNA进行反应,结果表明传感器未对这种基因发生反应。比较了2种传感器对李斯特细菌的灵敏度,探索了传感器噪声产生的原因。为了检测基因传感器对于质量的敏感程度,利用2种不同分子量相同浓度的互补ssDNA发生的杂交反应进行检测,检测结果表明纳米微悬臂梁传感器对于质量的变化不敏感。为了验证二氧化硅微悬臂梁传感器对于所检测样品信号的稳定性,对样品进行了不同浓度的多次检测,结果表明二氧化硅微悬臂梁传感器基因检测信号稳定,误差小。利用所设计的二氧化硅微悬臂梁传感器检测了原核表达产物LLO与所研制的单克隆抗体之间的免疫反应,虽然产生了较大的噪声,但是证实了传感器的灵敏度较高。利用p型二氧化硅微悬臂梁传感器检测了牛奶中的李斯特细菌。


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