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六种虫媒病毒蛋白芯片检测方法的建立

林方  
【摘要】:虫媒病毒(Arthropod viruses)是一大类通过嗜血节肢动物传播的病毒,通常引起人类发热性和脑炎样疾病,流行病学呈现明显的季节性与地域性,多爆发于蚊虫、蜱类等大量孽生的夏秋季节,严重危害人类健康与公共安全。由于一些虫媒病毒还能通过气溶胶途径传播,也是重要的病毒性生物战剂。虫媒病毒包括披膜病毒科、布亚病毒科、黄病毒科在内的多种病毒,其中以黄病毒属病毒感染的危害最大,在我国境内主要流行的虫媒病毒病包括流行性乙型脑炎、森林脑炎、登革热、新疆出血热,多是由黄病毒属病毒感染所致的传染病。虫媒病毒的致病机制尚不清楚,目前亦无有效的疫苗和抗病毒药物。早期、快速鉴定病原体是有效预防和控制虫媒病毒病的基础。 由于虫媒病毒感染的临床表现与流行病学特点相似,因此,准确检测与鉴定病原体显得尤为重要。目前,对于虫媒病毒抗体的临床检测技术仍以传统的免疫荧光(IFA)和ELISA检测为主,一次反应只能检测一种病原体。本研究以黄病毒属的流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、登革病毒(DENV)、西尼罗病毒(WNV)和甲病毒属的西部马脑炎病毒(WEEV)、东部马脑炎病毒(EEEV)为研究对象,建立能同时检测六种虫媒病毒抗体的蛋白芯片检测方法,为虫媒病毒病的临床诊断提供新的手段。检测原理是将病毒特异性诊断抗原作为捕获抗原点样制备蛋白芯片,利用抗原抗体反应的原理检测血清中的病毒特异性抗体,再通过与荧光标记的二抗反应进行结果的分析与判定。目前,国内外尚未见到蛋白芯片同时检测多种虫媒病毒抗体的报道。 本课题的主要研究结果如下: 1、虫媒病毒候选诊断抗原的表达、纯化及鉴定 本课题选择含有诱导中和抗体的抗原表位的重组抗原作为蛋白芯片检测技术的候选诊断抗原。研究表明,黄病毒属病毒的EDⅢ蛋白只包含诱导中和抗体的型与亚型特异性抗原表位,不含有诱导产生交叉反应抗体的抗原表位,NS1蛋白可诱导中和抗体,是目前疫苗研究与病毒免疫诊断的研究热点,PrM蛋白和NS3蛋白在黄病毒属中保守稳定,具有良好免疫原性,这两个蛋白均有作为病毒诊断抗原的报道。甲病毒属的E1蛋白含有中和性抗原决定簇,至少有4个非重叠的抗原表位,具有良好的免疫原性,是甲病毒属病毒免疫学检测的重要抗原之一。依据国内外对这两类病毒诊断抗原的研究进展,并结合我国病毒流行株的特点,本课题使用DNAstar与Primer5软件进行引物设计并添加适当的酶切位点,共设计了针对TBEV、JEV、DENV1、DENV2、DENV3、DENV4、YFV、WEE、EEE、WNV的17对PCR扩增引物。通过构建并鉴定重组表达质粒,在大肠杆菌中共表达了17个重组抗原,并采用镍离子亲和层析的方法进行了抗原的纯化。另外,利用灭活病毒免疫大白兔制备动物免疫血清,在完成其效价及特异性鉴定的基础上,采用ELISA方法通过动物免疫血清鉴定所表达的重组抗原的检测特异性,共获得12个具有良好特异性的诊断抗原,为进一步建立虫媒病毒蛋白芯片检测方法奠定了基础。 2、蛋白芯片检测方法的建立及条件优化 采用SpotArrayTM24点样仪将纯化后的17个候选诊断抗原作为捕获抗原点制于晶芯高分子三维基片上制备蛋白芯片,以兔IgG作为阳性对照,以含15%甘油的PBS为阴性对照,每个样本重复3点,点样后,玻片室温下自然风干4h。首先采用兔免疫血清与蛋白芯片进行反应,筛选可用于蛋白芯片检测方法的特异性良好的诊断抗原。通过分析,共筛选出12个特异性较好的重组抗原,与ELISA法筛选的结果一致,表明将不同病毒的诊断抗原在一张芯片上反应并不影响彼此的检测特异性。在此基础上,进行蛋白芯片检测条件的优化,优化结果显示,抗原点样浓度在0.125~0.6mg/ml之间可获得良好的检测特异性,血清检测范围可达到1:100~1:1000。蛋白芯片的最佳反应条件芯片封闭时间为2h、Cy3标记的羊抗兔IgG使用效价为1:1000、第二抗体反应时间为45min,蛋白样本稀释液中甘油的浓度为15%。在条件优化之后,再次用兔免疫血清进行蛋白芯片的验证,证明用优化后的反应条件及筛选到的12个诊断抗原可获得良好的检测特异性。 3.蛋白芯片检测方法的考核与验证 建立虫媒病毒蛋白芯片检测方法的最终目的是将其应用于虫媒病毒感染患者的临床诊断,为虫媒传染病的诊断和治疗提供重要的病原学依据。因此,在建立蛋白芯片检测方法之后,采用临床血清标本对芯片的实际检测效果进行了考核与验证。共收集了33份疑似森林脑炎病毒感染血清、8份疑似乙型脑炎病毒感染血清、22份疑似登革病毒感染血清,以及20份正常人血清作为阴性对照。首先,采用以灭活全病毒作为抗原的IFA方法对样本进行了检测,然后用筛选出的12个诊断抗原作为包被或捕获抗原,采用ELISA方法和优化后的蛋白芯片方法进行了平行检测,以比较其检测效果。在33份疑似森林脑炎病毒感染血清中,IFA方法检测结果为21份IgG抗体阳性,23份IgM抗体阳性;在重组抗原的平行检测中,ELISA和蛋白芯片的检测结果均为16份IgG抗体阳性、17份IgM抗体阳性,检测符合率达到100%;对8份疑似乙型脑炎病毒感染血清的检测中,IFA检测到8份IgG抗体阳性,6份IgM抗体阳性,ELISA法检测到4份IgG抗体阳性、5份IgM抗体阳性,而蛋白芯片法检测到5份IgG抗体阳性和5份IgM抗体阳性,检出率稍高于ELISA法;对22份疑似登革病毒感染血清的检测结果为:ELISA检测13份IgG抗体阳性,15份IgM抗体阳性,而蛋白芯片法检出14份IgG抗体阳性,15份IgM抗体阳性,检出率稍高于ELISA法。ELISA与蛋白芯片方法检测出的阳性血清标本编号一致,而且均在IFA检测的阳性标本范围中。经Kappa检验后,证明蛋白芯片与ELISA具有良好的一致性。正常人血清样本检测结果均为阴性。蛋白芯片法在检测出DENV抗体阳性的基础上,可以同时对标本进行血清学分型。以重组抗原为捕获抗原的蛋白芯片与ELISA法的阳性检出率均低于以全病毒为抗原的IFA方法。为提高蛋白芯片方法的敏感性,以TBEV为例,用EDⅢ与NS1抗原组合作为诊断抗原进行检测,共检出18份IgG阳性血清和18份TBEV IgM阳性血清,比单一TBE-EDⅢ抗原多检出IgG抗体阳性标本2份,IgM阳性标本1份,证明应用组合抗原可提高抗体阳性标本的检出率。 通过对诊断抗原的鉴定与筛选以及对蛋白芯片检测条件的优化,本研究建立的6种虫媒病毒蛋白芯片检测方法获得了较好的检测特异性与敏感性,对临床血清标本的检测特异性达到100%,敏感性稍高于传统的ELISA法。进一步的研究结果表明,采用组合的诊断抗原,可以提高蛋白芯片的阳性检出率。与传统的IFA和ELISA抗体检测方法相比,蛋白芯片除具有检测通量高的优势外,还可以节约检测成本、缩短检测时间以及减少对抗原和临床样本的需求量。本课题首次建立了可用于同时检测6种不同虫媒病毒抗体的蛋白芯片方法,并可对DENV的不同血清型进行分型,为虫媒病毒病的临床诊断提供了新的技术手段。


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