蛋白质组学和代谢组学技术筛选颅脑损伤促进骨折愈合的关键分子

【摘要】：临床实践证据显示颅脑损伤能够加速骨折愈合。早期临床观察发现颅脑损伤合并骨折的患者比单纯骨折患者的骨折愈合快、骨痂生长快且数量多。这一现象引起了各国学者的关注，愈来愈多的证据表明颅脑损伤与异位骨化（HO）、快速的骨连接和肥大骨痂密切相关。近期有报道显示颅脑损伤患者血清和脑脊液（CSF）能够促进成纤维细胞、间充质干细胞（MSC）和前体成骨细胞的增殖，这些发现表明颅脑损伤患者血清和脑脊液具有骨诱导的潜能。颅脑损伤后可能由于血脑屏障（BBB）的破坏或机体的系统反应造成血液内一些分子浓度改变，这些差异分子进一步调节了患肢骨折的愈合。已发现有多种分子参与这一事件，例如生长激素、转化生长因子、神经生长因子、白介素1（IL1）和白介素6（IL6）等。到目前为止，虽然对颅脑损伤加速骨折愈合的现象得到普遍认同，但其病理生理学机制仍然存在着广泛的争议，并且早期研究主要是针对已知某个或某几个分子展开研究，很少有采用组学技术对这一现象展开系统研究。 本论文的研究目的是首先利用最新的生命组学技术，研究颅脑损伤血清中生物活性分子表达谱，筛选颅脑损伤后血清中的差异分子。然后对差异分子与颅脑损伤的关系进行初步探讨，为全面、深刻地理解颅脑损伤加速骨折愈合这一现象提供新的依据和线索，还可能寻找到具有潜在应用前景的促进骨折愈合的分子。 本论文由五部分组成。第一部分研究了颅脑损伤对骨折愈合质量的影响。在建立稳定可靠的动物模型基础上，采用影像、病理和组织学技术证明颅脑损伤合并骨折大鼠患肢骨折位点骨密度和矿化程度高、骨小梁大、成骨细胞多且胞浆丰富。细胞和分子水平研究显示颅脑损伤大鼠血清能够促进成骨细胞（MC3T3-E1）增殖和调节骨钙素（BGLAP）的表达，由此推测颅脑损伤加速骨折愈合很可能是通过调控成骨细胞的增殖和矿化的形成而实现的，并为后续差异分子的筛选奠定基础。 第二部分阐述基于双向电泳和质谱技术的颅脑损伤大鼠血清比较蛋白质组学研究。应用高分辨率的分离和高通量的鉴定技术，分析颅脑损伤后不同时间血清蛋白表达谱，成功鉴定颅脑损伤24小时显著上调的触珠蛋白（Hp）。进一步研究表明颅脑损伤后白介素6调节肝脏合成触珠蛋白，分泌进入血液循环系统，同时白介素6在颅脑损伤后血清中也显著升高。对触珠蛋白和白介素6的生物信息学分析显示它们均为炎症调控的重要分子，由此推测它们可能在骨折愈合的炎症期扮演重要角色。 第三部分阐述基于气相色谱和质谱技术的颅脑损伤大鼠血清代谢组学研究。代谢组学（Metabonomics/metabolomics）是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。应用此技术成功筛选鉴定出8个差异代谢小分子，其中花生四烯酸（AA）在颅脑损伤后显著上调。细胞和分子水平研究显示花生四烯酸能够促进成骨细胞增殖和调节骨钙素的表达。有报道显示骨折愈合速度主要取决于炎症期、软骨痂和硬骨痂形成期，而骨折修复的机械强度主要与骨重建期合成和分解的平衡有关。因此，花生四烯酸可能通过加速成骨细胞的成熟调控软骨痂和硬骨痂的形成。 第四部分阐述基于液相色谱串联质谱和芯片技术的颅脑损伤大鼠血清多肽和microRNA（miRNA）表达谱研究。愈来愈多的证据显示小分子多肽和miRNA在生物体内发挥着重要功能，它们在多个层次调节机体的病理生理过程。通过肽组学和miRNA芯片技术检测颅脑损伤大鼠血清多肽和miRNA表达谱，筛选差异多肽和miRNA，弥补前期蛋白质组学和代谢组学研究的不足，为颅脑损伤促进骨折愈合这一现象的探讨提供新的线索。 第五部分阐述应用比较蛋白质组学技术对短暂性脑缺血发作（TIA）患者血清标志物的筛选。短暂性脑缺血发作患者是脑卒中发病的高危人群。尽管目前有先进的影响学诊断方法，但临床早期诊断短暂性脑缺血发作仍然存在很大挑战。应用基于凝胶分离技术的比较蛋白质组学方法研究短暂性脑缺血患者血清表达谱，成功鉴定5个差异蛋白，并在短暂性脑缺血模型动物血清中得到验证。对于这些差异蛋白研究或结合已有的诊断方法很可能提高临床短暂性脑缺血发作早期诊断的准确性，从而减少高危人群发展成脑卒中或死亡。但差异蛋白仍需要大样本的验证，进一步评价其灵敏度和特异性，以及假阳性和假阴性的判别率。