采用外周血进行肿瘤分子诊断的转化医学研究

【摘要】：背景目的： 恶性肿瘤是我国城市居民和农村居民死亡率最高的疾病，与其他常见病种所不同的是，同样的治疗方案在不同肿瘤患者之间的疗效差异巨大，造成这一现象的根本原因在于各个患者之间的分子分型存在很大的差异。因此，通过分子诊断来明确患者的基因表型，进而根据这种分子表型为患者制定个体化的治疗方案，这样一种观念越来越成为肿瘤治疗的共识。人表皮生长因子受体（HER）家族在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用，该家族成员的分子分型是肿瘤治疗所关注的焦点。 但是，由于在临床上实时获取患者的肿瘤组织是不现实的，因此很难实现对患者基因表型的动态实时观测，这在某种程度上影响了患者个体化治疗方案的制定。相反，在肿瘤患者的外周血中有来自于肿瘤组织的核酸物质以及循环肿瘤细胞，这些材料的获取相对微创和方便，被认为是进行分子诊断的理想材料来源。但是，通过外周血进行分子诊断的流程还不够标准和完善，其临床相关性也有待于进一步的考察。 本研究将以临床常见的肺癌和乳腺癌为主要的研究对象，通过外周血的核酸检测、循环肿瘤细胞的检测和分型来回答和解决临床治疗中的问题，为合理、有效开展肿瘤患者的个体化治疗提供有益的帮助。 材料方法： 1、采用体液（胸水和血浆）检测NSCLC患者EGFR突变： 从采用体液（胸水、血浆）进行常规EGFR测序检测的患者中选择适合的样本，采用敏感性更高的ARMS法对样本进行复检，结合患者使用TKI药物的临床治疗情况，分析并讨论外周血EGFR突变检测的可行性方案。 2、肺癌患者循环肿瘤细胞（CTC）的检测及分子分型： 采用CellSearch系统分别检测NSCLC和SCLC患者外周血中CTC的数目。对于NSCLC患者，提取CTC的DNA，进行EGFR测序检测。对于SCLC患者，在CellSearch系统检测过程中，加入IGF-1R抗体，检测该抗体在CTC上的表达情况。 3、循环肿瘤细胞（CTC）检测对乳腺癌患者预后的判断： 采用CellSearch系统检测转移性乳腺癌患者外周血中CTC的数目，根据CTC的数目进行Kaplan-Meier生存曲线分析，采用log-rank检验对曲线进行对比。分别采用单变量和多变量Cox回归分析来评价CTC的预后价值。 4、乳腺癌循环肿瘤细胞（CTC）分型检测预测靶向治疗疗效： 采用CellSearch系统检测HER2阳性乳腺癌患者外周血中CTC的数目并检测其HER2表达状态，根据基线时CTC的水平以及CTC的HER2状态分别进行Kaplan-Meier生存曲线分析，采用log-rank检验对曲线进行对比。采用McNemar’s检验分析HER2状态在CTC和组织学结果之间的差别。 研究结果： 1、采用体液（胸水和血浆）检测NSCLC患者EGFR突变： 与直接测序法相比，ARMS法确认了16例突变阳性和另外23例突变阴性标本，另有11例之前阴性的标本（6例胸水，5例血浆）被重新判定为阳性，这11例患者均取得了较好的临床疗效（7PR,3SD,1PD）。突变阳性患者的ORR非常显著，对于胸水标本，直接测序法和ARMS法分别是81.3%和72.7%，对于血浆标本为80%（ARMS法）。值得注意的是，即使采用敏感性更高的ARMS法，突变阴性患者的ORR仍然较高，胸水标本为60%，而血浆标本为46.2%。 2、肺癌患者循环肿瘤细胞（CTC）的检测及分子分型： 一线NSCLC患者CTC的检出率为44.6%（25/56），二线NSCLC患者CTC的检出率有所提高，为55.8%（24/53）。其中1例患者完成了EGFR的突变检测，结果显示为19外显子缺失。SCLC患者CTC的检出率高达81.3%（26/32），明显高于NSCLC。不管是何时检测，CTC上均未发现IGF-1R蛋白的表达。 3、循环肿瘤细胞（CTC）检测对乳腺癌患者预后的判断： 基线完成有效检测294例，CTC的检出率为61%（179/294），CTC≥5的患者有115例（39%）。不论是基线时检测还是在3-4周、6-8周检测，CTC均可以较好的预测患者的PFS和OS。而在治疗过程中CTC数目的降低可以预示患者治疗的获益。单变量和多变量的Cox回归分析均显示，CTC数值对于PFS和OS来说都是独立的预后因素。 4、乳腺癌循环肿瘤细胞（CTC）分型检测预测靶向治疗疗效： HER2阳性MBC患者的CTC检出率为45%（27/60），以1个CTC为界对患者进行分组，两组患者之间中位PFS存在显著性差异（2.5比7.5个月, P=0.0125）。我们提出了一种CTC HER2阳性的标准，即大于30%的CTC过表达HER2（3+）。对于进行抗HER2治疗的患者（n=18），只有CTC HER2阳性的患者可以受益（中位PFS为8.8比2.5个月, P=0.002）；同时，在CTC HER2阳性的患者中（n=13），接受抗HER2治疗患者的中位PFS要明显长于其他患者（8.8比1.5个月, P=0.001）。值得注意的是，高达51.9%（14/17）的组织学HER2阳性的患者其实为CTC HER2阴性的，这部分患者接受抗HER2治疗并不能够显著的提高其中位PFS（2.5比0.9个月, P=0.499）。 研究结论： 1、当采用体液标本进行NSCLC患者的EGFR突变检测时，不论采用何种检测方法，突变阳性结果都是非常理想的TKI用药指标，其疗效预测效果并不亚于肿瘤组织。相反，对于突变阴性结果（即使是更敏感的ARMS法检测到的），由于其与TKI治疗的相关性不佳，我们应该引起高度警惕。 2、NSCLC患者的CTC检测和在CTC上实现EGFR突变检测都是可行的，只是NSCLC患者的CTC检出率略低，对其进行分子分型可能还需要更为敏感的CTC捕获技术。相反，SCLC患者的CTC整体检出率较高，而且CTC的数目也较多，便于实时检测以评价患者的疗效。不过,在SCLC患者的CTC上并未检测到IGF-1R蛋白的表达。 3、在检测中国转移性乳腺癌人群CTC时，CellSearch系统的检测性能与临床预测价值并不亚于西方人群，可以很好的预测患者的PFS和OS。同时，CTC数值在治疗过程之中的变化也可以很好的反映患者的疗效。与传统的影像学相比，CTC的检测具有早期、动态、量化等优势。 4、HER2阳性MBC患者CTC的检出率较低，因此对此类患者应该调整CTC的阈值。将阈值于≥5调整为≥1之后，CTC计数可以为HER2阳性的MBC患者提供较好的预后信息。CTC HER2状态与肿瘤组织之间存在着很大的差别，通过CTC的HER2分型可以有效的提高抗HER2治疗的疗效预测。我们的研究结果强烈提示了在HER2阳性的MBC患者中开展CTC分析的重要性和必要性。