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紫杉醇纳米晶体的制备及抗肿瘤研究

魏丽莎  
【摘要】:目的:本研究选取紫杉醇作为难溶性的模型药物,制备一种新型纳米药物递送系统—紫杉醇纳米晶体;并以紫杉醇市售注射液为对照药,研究紫杉醇纳米晶体在体内及体外的抗肿瘤药效;由此评价纳米晶体技术应用于提高肿瘤化疗疗效的优势及可行性。 内容:以纳米晶体的外观、粒径、电位等作为主要评价指标,进行紫杉醇纳米晶体的处方工艺研究,以确定最优处方组成及最佳工艺条件;通过粒度分析仪、透射电镜、X射线衍射仪和差示扫描量热法等对紫杉醇纳米晶体进行物理表征,观察测定紫杉醇纳米晶体的粒径、形貌及晶型等微观特征;建立了紫杉醇含量测定的方法,通过紫杉醇纳米晶体与紫杉醇原料药的溶解度及体外释放特性的对比研究,评价紫杉醇纳米晶体在提高药物溶解度及释放速率等方面的纳米效应;通过细胞毒性实验初步评价紫杉醇纳米晶体对癌细胞的杀伤作用;在紫杉醇纳米晶体和紫杉醇市售注射液的药代动力学研究中,评价两种剂型的药代动力学特征;其次,构建了荷瘤裸鼠模型,采用紫杉醇市售注射液作为参比制剂,对紫杉醇纳米晶体进行药效学研究;最后,采用活体成像技术对紫杉醇纳米晶体的肿瘤靶向性进行评价。 方法:采用反溶剂沉淀法制备紫杉醇纳米晶体,以单因素试验设计进行处方工艺及冻干工艺的筛选;采用动态光散射法和透射电镜对纳米晶体的粒径、Zeta电位及粒子形貌进行测量;通过X射线衍射仪和差示扫描量热法对纳米晶体的晶型特征及相变温度进行鉴定;采用HPLC法进行紫杉醇含量测定;采用摇床法及溶出法进行紫杉醇纳米晶体和紫杉醇原料药的溶解度及体外释放实验;采用MTT法评价紫杉醇纳米晶体和紫杉醇市售注射液对乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒作用,绘制细胞存活率曲线进行比较,并进行统计分析;采用液相色谱-串联质谱(LC-MS)法对紫杉醇纳米晶体及紫杉醇市售注射液的药代动力学特征进行研究;建立荷瘤裸鼠模型,以肿瘤抑制率为评价指标,对紫杉醇纳米晶体和紫杉醇市售注射液进行抑瘤效率评价,同时,对两种制剂在荷瘤小鼠的组织分布情况进行评价;通过活体成像系统观察荧光标记的紫杉醇纳米晶体和紫杉醇市售注射液对肿瘤部位的靶向效果。 结果:通过单因素试验确定了紫杉醇纳米晶体的初始处方组成由泊洛沙姆407和多库酯钠组成,最佳的工艺是通过真空抽滤法除去有机溶剂及大部分表面活性剂;所制备的紫杉醇纳米晶体粒径较小、电位稳定、分布均匀,平均粒径为194.9nm,PDI为0.138,Zeta电位值为-29.6mV;紫杉醇纳米晶体冻干粉末复溶后的平均粒径为217.5nm,PDI为0.149,Zeta电位值为-27.3mV,各参数无显著变化;透射电镜结果显示紫杉醇纳米晶体表面光滑,呈杆状均匀分布;X射线衍射测定结果表明紫杉醇纳米晶体大部分以无定形结构存在,只存在几种定形结构晶型; DSC测定结果显示紫杉醇纳米晶体的相变温度降低;紫杉醇纳米晶体能有效提高药物溶解度及体外释放速率;紫杉醇纳米晶体和紫杉醇市售注射液对MCF-7细胞的细胞毒作用与药物浓度及作用时间有关,两种剂型都明显抑制了癌细胞的增殖。 紫杉醇纳米晶体和紫杉醇市售注射液在小鼠体内的药-时曲线符合二房室模型,t1/2,α分别为(2.909±0.067)和(3.696±0.063) min,t1/2,β分别为(69.41±0.73)和(53.94±0.62) min,AUC(0-∞)分别为(276700±960)和(464160±710) μg min/L,CL分别为(0.036±0.011)和(0.022±0.010) L/(min kg);与紫杉醇市售注射液相比,紫杉醇纳米晶体在小鼠肝、脾组织中药物浓度显著增加(P0.01),而在心、肾组织中药物浓度则显著减少(P0.001),但在肺组织中无显著性差异;药效学评价显示,与紫杉醇市售注射液相比,紫杉醇纳米晶体在肿瘤组织中药物浓度显著增加(P0.01),纳米晶体能够增加药物在肿瘤组织的蓄积量及延长蓄积时间;抗肿瘤评价结果表明高剂量的紫杉醇纳米晶体和紫杉醇市售注射液均具有明显的抑瘤效率,两者的肿瘤重量抑制率分别达到85.51%,91.06%,肿瘤体积抑制率分别为81.83%,86.55%,但是紫杉醇市售注射液治疗组出现了严重的毒性反应,小鼠死亡率高达83.3%(六只出现五只死亡),而紫杉醇纳米晶体治疗组却未发生动物死亡,有效改善了小鼠存活状况并提高生存率;荧光成像结果显示紫杉醇市售注射液在荷瘤裸鼠体内潴留时间短,主要蓄积在心、肺、肾、膀胱等部位,肿瘤部位无明显的荧光,而紫杉醇纳米晶体在荷瘤裸鼠体内潴留时间更长,尤其在肿瘤部位及靠近肿瘤的部位有大量蓄积,且能够较长时间维持较高的浓度。 结论:通过反溶剂沉淀法制备的紫杉醇纳米晶体的平均粒径在200nm左右,呈杆状分布,电位比较稳定,冻干粉末复溶后的各项参数未见显著变化;将紫杉醇原料药制备成纳米晶体后,药物分子由定形结构晶型转化成无定形结构,且相变温度降低;紫杉醇纳米晶体大大提高了药物的溶解度和体外释放速率;紫杉醇纳米晶体具有较强的细胞毒作用,能显著抑制癌细胞增长;紫杉醇纳米晶体能够快速地分布于周围组织中,主要被肝、脾吸收,能有效降低心、肾毒性,且增加在肿瘤组织的蓄积量;同时可有效抑制肿瘤的生长,疗效显著,且无明显的毒副作用,对减轻药物毒副作用具有重要的临床意义。 综上所述,基于纳米给药技术构建的紫杉醇纳米晶体递送系统对肿瘤具有良好的靶向性,能够大量蓄积于肿瘤部位,具有显著的抗肿瘤效果,同时减轻了紫杉醇市售注射液治疗时的毒副作用。总而言之,紫杉醇纳米晶体具有成为应用于肿瘤临床治疗新剂型的重大潜能,具有临床研究意义。


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