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MTAP在人BEP2D细胞辐射致癌模型和非小细胞肺癌中的缺失和表达研究

李邦印  
【摘要】: 在自然环境中,天然辐射的50%来自于氡及其子体放射出来的α粒子,高水平的氡及其子体是诱发原发性肺癌的重要因素之一。对此,尽管人们已有深刻认识,但是时至今日氡及其子体诱发肺癌的分子机理仍未完全阐明。本实验室采用人支气管上皮细胞BEP2D建立了α粒子辐射致恶性转化的细胞模型,照射后第35代细胞接种于裸鼠皮下可形成高分化的鳞癌,继续分离培养获得了BERP35T1—BERP35T-6多株恶性转化的单克隆细胞,在国内率先开展了辐射致肺癌机制的研究。 蛋白质组水平的研究发现,BEP2D永生化细胞和BERP35恶性转化细胞中有多种蛋白质存在表达差异,其中MTAP、HMG-1在恶转细胞中表达降低,而Maspin在癌前阶段表达下降。在此基础上,我们以BEP2D细胞为对照,通过双向电泳技术对恶性程度更高的BERP35T-2细胞进行分析,并通过Northern杂交发现在BERP35T-2中MTAP的mRNA表达水平比BEP2D细胞中降低5倍以上。 MTAP(Methylthioadenosine Phosphorylase,甲硫腺苷磷酸化酶),是甲硫氨酸和嘌呤合成补救途径的第一个酶,专门司职催化多胺代谢的副产物MTA(Methylthioadenosine,甲硫腺苷),使之生成腺嘌呤和甲硫核糖-1-磷酸(5-methylthio-D-ribose 1-phosphate,MTR-1-P),最后形成ATP、dAMP和甲硫氨酸,分别参与细胞的能量合成、DNA合成和蛋白质合成。MTAP催化的是可逆反应,在正常细胞中有非常重要的作用。 关于MTAP基因在肺癌或BEP2D辐射致癌细胞模型中的研究,在国内并无相关报道,这促使我们围绕MTAP基因组及其邻近基因(组)结构在辐射致癌模型和原发性非小细胞肺癌中展开了调查研究,主要取得了以下几个方面的结果: 1.在细胞模型中,MTAP基因在辐射诱发支气管上皮BEP2D细胞恶性转化过程中表达显著降低,蛋白质水平和转录水平差别均在5倍以上。 军事医学科学院卫生毒理学专业博士学位论文2003年6月 SSCP方法检测发现MTAP基因在BERP35T-2中没有发生突变;PCR分析 也没有纯合性缺失和启动子异常甲基化现象;但MTAP基因组附近的微卫 星位点RH99034发生了杂合性缺失(1055 of heterozygosity,LOH),这可能 是表MTAP达下调的原因。这些结果提示该基因可能与细胞的恶性转化有 关。 2.Ml,AP基因在非小细胞肺癌中的纯合性缺失研究。采集了44例原 发性非小细胞肺癌,用PCR一ELISA方法分析,发现有9.1%的病例(4/44) MTAP基因发生了纯合性缺失。而据文献报道经常与之高比例共缺失的 P16基因,只检测到6.8%的(3/44)纯合性缺失率。提示低频率的纯合性 缺失可能是Ml,AP在肺癌中失活的原因之一。 3.MTAP基因启动子异常甲基化和突变分析。采用MSp(Methylation 一sPecific PcR)原理针对MTAP启动子设计了引物,对44例非小细胞肺 癌的基因组DNA处理后进行PCR扩增。发现MTAP启动子异常甲基化的 比例为6.8%(3/44),说明启动子异常甲基化可能是MTAP基因失活的因 素之一。SSCP分析发现Mrl人P在非小细胞肺癌中没有发生碱基突变。这 说明MT人P基因表达调节可能不是靠碱基突变方式控制的。 4.MTAP在非小细胞肺癌中的杂合性缺失研究。在MTAP基因组附近 选取了7个STS标志:D95162、D951749、D95916、RH99034、D951748、 D951752和D95977。对之进行分析,发现7个STS的LOH频率分别为: 1 3.8%(5/36)、56.2%(18/32)、54.2%(17/33)、70.3%(19/27)、57.1 %(16/28)、30.8%(8/26)和13.3%(4/30)。其中44例标本中61.9%(26/42) 至少有一个STS位点发生LOH现象。中低分化肺癌中LOH比例显著高于 高分化肺癌。这些结果说明gpZI区域高频率的LOH现象可能是导致MTAP 基因表达变化的主要原因,并且与肿瘤的分化程度有关。此现象提示Ml,AP 在非小细胞肺癌中表达降低或丢失可能独立于pl6缺失,说明其缺失或低 表达可能有其肿瘤生物学基础。 5.Ml,A.P在非小细胞肺癌中翻译和转录水平的验证。选用了15例新 鲜肺癌标本,进行RT-PCR分析,发现Ml,AP在73.3%(11/15)的肿瘤标 本中不表达或转录水平降低5倍以上,而MJTAP在正常对照组织中的表达 率却高达93.3%(14/15)。对n例Rr‘PCR分析认定低表达或不表达的样 军事医学科学院卫生毒理学专业博士学位论文2003年6月 本,用Western Blot方法进一步验证,发现与RT‘PCR结果一样,基本与 在基因组水平分析的结论一致。MTAP在肺腺癌和鳞癌中低表达现象无显 著差异,但在中/低分化肺癌中低表达率显著高于高分化肺癌,再次提示 MTAP基因低表达或丢失可能与肿瘤的恶性程度密切相关。 6.研究MTAP的同时,本研究分析了与MTAP基因连锁的P16、P14 和P15等抑癌基因在肿瘤标本中转录水平的变化。RT.PCR方法分析,发 现与正常组织相比,P15在7例肺癌标本中有5例基本不表达;在7例标 本中,意外地发现P16和P14在正常组织中转录水平很低,RT.pCR方法 基本无法检测到相应cDNA,而在配对的肺癌组织中却分别有3例高表达。 这提示MTAP的缺失可能是独立于pl6之外的,其低表达或缺失在肿瘤生 物学中并不是偶然现象,可能有其特殊的生物学意义等待发掘。 本研究的创新


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