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端粒酶的放射损伤修复机制及对肿瘤细胞凋亡调控的实验研究

邹跃  
【摘要】:端粒酶在85%~90%人肿瘤细胞高表达。肿瘤放疗是肿瘤治疗主要手段之一。细胞凋亡与潜在致死性损伤修复是决定放疗疗效的生物学基础。端粒是放射损伤的敏感位点。目前对端粒损伤修复是否是潜在致死性损伤修复中重要的机制还未见有学者明确提出,对端粒酶如何参与端粒损伤的修复及凋亡的调控机制了解还很少。目前端粒修复可能影响凋亡的观点还缺乏充分的实验依据支持。本研究目的是阐明端粒酶参与端粒潜在致死性损伤修复和调控射线诱导凋亡的机制和规律,最终将端粒酶应用于临床以改善肿瘤放疗疗效。本课题采用TRAP、southern blotting、RT-PCR、流式细胞术及原位端粒酶-凋亡双染等方法对端粒酶的放射损伤修复机制和调控凋亡作用进行了系统深入的研究,并在此基础上将新的反义技术RNAi引入抑制端粒酶、增强射线诱导凋亡的研究中,结果表明端粒酶是一个修复放射损伤、抑制凋亡的重要因素。其中原位端粒酶-凋亡双染技术方法及其所获得的结果国内外尚未见报道,此技术方法通过本实验证明是成功的;对RNAi在放射损伤领域所进行的研究为探索性,也未见国内外报道。根据实验结果,提出了端粒酶通过在端粒部位合成端粒序列(端粒延长)修复端粒而调控凋亡是潜在致死性损伤修复的重要机制,进一步完善了潜在致死性损伤修复和凋亡调控机制,为端粒酶检测应用于临床预测肿瘤细胞放射敏感性,及为抑制端粒酶提高放射抗拒肿瘤的放疗效果提供了理论依据。实验获得的重要结果如下: 1.通过以RT-PCR为基础的TRAP方法和原位杂交法检测了A549和L02端粒酶活性和hTERT表达。结果显示,经1Gy-5Gy γ射线照射,端粒酶活性水平提高了1.3-2.5倍,照射后48h~72h达高峰,呈时间和剂量依赖性,证实射线可诱导端粒酶表达增强。实验还证实存在hTERT转录水平提高的机制。 2.采用原位端粒酶-凋亡双染色法,直接证实了凋亡细胞中端粒酶表达依然保持高水平,并发现在射线诱导细胞凋亡过程中端粒酶表达增强,说明射线杀伤效应不是通过抑制端粒酶的机制。A549端粒酶表达水平高而凋亡率低,L02则与之相反,两者间显示出的酶活性水平与凋亡率的剪刀差关系,表明端粒 军事医学科学院卫生毒理学博士学位论文2004年5月 酶可修复损伤DNA,是一个射线诱导凋亡抑制因素。 3.Southern杂交检测TRF发现,照射后细胞端粒延长Ikb,并与端粒酶表达增 强有相近似的剂量效应和时间效应,证明端粒序列的合成是端粒放射损伤修 复的主要途径,阐明了端粒酶可通过调控端粒长度、封闭凋亡启动感应位点 而调控射线诱导凋亡敏感性的机制。结果提示,监测肿瘤细胞端粒酶表达水 平可预测放疗敏感性。基于上述实验结果,拟建了一条利用端粒酶改善肿瘤 放疗疗效的原理线路:射线一端粒损伤~端粒酶激活~修复端粒及基因组. 端粒序列(参与潜在致死损伤修复)~封闭凋亡启动、调控射线诱导凋亡敏 感性一预测肿瘤细胞放射敏感性,抑制端粒酶提高抗放肿瘤对射线的敏感性 一改善临床放疗疗效。 4.在较充分掌握了端粒酶调控射线诱导凋亡机制和规律的基础上,进一步研究 端粒酶抑制剂对端粒酶表达和射线诱导肿瘤细胞凋亡的影响。TRAP一ELIsA 显示AZT(0.05、Ilnlnol/L)可显著抑制A549和L02端粒酶活性,并可诱导凋亡。 但FcM显示照射后48h AZT/照射联合组凋亡率与照射组或AZT组无差异,联 合组仅显示出AZT细胞毒性,然而细胞生长曲线则显示联合组细胞存活率显 著低于照射组,提出了AZT急性细胞毒性作用和增强射线诱导凋亡的联合作 用机制模式。 5.探索性将RNAi技术用于抑制端粒酶、增强射线诱导凋亡的研究中。构建了 干扰hTERT mRNA的pPUR/hTERT表达载体,用脂质体介导转染A549,筛选 了稳定表达株。转染后40d,端粒酶活性抑制,RT一PCR显示hTERT表达降低, 射线诱导端粒延长的作用部分受抑制,FCM显示1Gy’5Gy照射后24h pPUR/hTERT表达组凋亡率显著高于对照组。结果表明,抑制端粒酶的放射损 伤修复作用可提高射线诱导凋亡,进一步证明了端粒酶修复端粒损伤是潜在 致死性损伤修复的重要机制,同时提示siRNA可作为端粒酶抑制剂,预示了 其可改善抗放肿瘤对射线的反应,具有提高肿瘤放疗效果的临床发展前景。


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